Agerraldiaren hasierako fasean, garapen azkarra dela eta, ustezko pazienteen diagnostiko azkarra da COVID-19 prebenitzeko gakoa.Onartutako azido nukleikoen detektatzeko erreaktibo batzuek garapen-denbora laburra dute, eta arazoak daude, hala nola, errendimendu azkarreko berrespena, erreaktiboen optimizazio nahikoa ez izatea eta loteen arteko alde handiak;Azido nukleikoen detekzio prozesuaren hainbat alderditan hainbat laborategi klinikoren arazoek azido nukleikoen detekzioaren emaitzen zehaztasuna ere eragin dezakete.Artikulu honek egungo SARS-CoV-2 azido nukleikoaren detekzioan dauden lotura eta puntu gakoetan zentratuko da, eta laborategiko azido nukleikoen detekzioaren eta koherentzia klinikoaren negatibo faltsuen eta positiboen berrikustearen arazoak aztertuko ditu.

SARS-CoV-2 azido nukleikoaren detekzioaren printzipioak

SARS-CoV-2 ARN birusa da, 29 kb inguruko genoma sekuentzia duena, 10 gene dituena, 10 proteina eraginkortasunez kode ditzaketenak.Birusak ARN eta proteinaz osatuta daude, eta kanpoko geruza lipidoz eta glikoproteinez osatutako kanpoko estaldura da.Barruan, kapside proteinak RNA biltzen du, eta horrela erraz degrada daitekeen RNA (P1) babesten du.

P1 SARS-COV-2ren egitura

Birusek zelulak inbaditzen dituzte zelulen gainazaleko hartzaile espezifikoen bidez infekzioa sortzeko, eta ostalari-zelulak erabiltzen dituzte errepikatzeko.

Azido nukleiko birikoaren detekzioaren printzipioa ARN birikoa zelula-lisatu baten bidez azaltzea da, eta, ondoren, denbora errealeko alderantzizko transkripzio-polimerasaren erreakzio fluoreszentea (RT-PCR) erabiltzea detektatzeko.

Detekzio-printzipioaren gakoa azido nukleikoen sekuentzien "norakoan parekatzea" lortzeko abiarazleak eta zundak erabiltzea da, hau da, beste birusetatik desberdina den SARS-CoV-2ren azido nukleikoen sekuentzia aurkitzea 30.000 base ingurutan (azido nukleikoaren antzekotasuna beste birus batzuekin) "Baxua" eremua), abiarazleak eta zundak diseinatzea.

Primerak eta zundak oso bat datoz SARS-CoV-2 azido nukleikoaren eskualde espezifikoarekin, hau da, espezifikotasuna oso indartsua da.Probatu beharreko laginaren denbora errealeko RT-PCR fluoreszentearen anplifikazioaren emaitza positiboa denean, SARS-CoV-2 laginean dagoela frogatzen du.Ikus P2.

P2 SARS-CoV-2 azido nukleikoaren zehaztapenaren urratsak (RT-PCR fluoreszente denbora errealean)

SARS-CoV-2 azido nukleikoa detektatzeko laborategiaren baldintzak eta baldintzak

Azido nukleikoen saiakuntza-laborategiak aproposenak dira presio negatiboko inguruneetarako, eta presioaren monitorizazioari erreparatu behar diote, airea isurtzen mantendu eta aerosolak ezabatu.Azido nukleikoen probak egiten dituzten langileek dagokien titulazioa izan behar dute, polimerasa-kate-erreakziorako prestakuntza egokia jaso eta ebaluazioa gainditu behar dute.Laborategia zorrozki kudeatu behar da, tokian toki banatuta, eta garrantzirik gabeko langileak sartzea erabat debekatuta dago.Eremu garbia aireztatu eta desinfektatu behar da.Elementu garrantzitsuak zonaldeetan jartzen dira, garbiak eta zikinak bereizten dira, garaiz ordezkatzen dira eta lekuan deskontaminatzen dira.Ohiko desinfekzioa: kloroa duen desinfektatzailea da eremu handiagoetarako irtenbide nagusia, eta %75eko alkohola eremu txikietarako erabil daiteke.Aerosolei aurre egiteko modu ona aireztapenerako leihoak irekitzea da, eta airearen desinfekzioa ere egin daiteke izpi ultramoreen, iragazketa eta airearen desinfekzioen bidez.

SARS-CoV-2 azido nukleikoaren determinaziorako funtsezko loturak eta parametroak (RT-PCR fluoreszente denbora errealean)

Laborategiek, oro har, azido nukleikoen “detekzioari” arreta handia ematen dioten arren, izan ere, azido nukleikoen “erauzketa” detekzio arrakastatsuaren funtsezko urratsetako bat da, birusen laginak biltzearekin eta biltegiratzearekin oso lotuta dagoena.

Gaur egun, gehien erabiltzen diren arnas-laginek, hala nola nasofaringe-lapiak, bigarren metodoa erabiltzen dute, hau da, azido nukleikoen erauzketan eta lisi-soluzioan oinarrituta prestatutako inaktibazio (kontserbazioa) disoluzioa.Alde batetik, birusak kontserbatzeko irtenbide honek birusaren proteina desnaturalizatu dezake, bere jarduera galdu eta infekziosorik ez izateko, eta garraio eta detekzio fasearen segurtasuna hobetu;bestetik, birusa zuzenean pitza dezake azido nukleikoa askatzeko, azido nukleikoa deskonposatzen duen entzima ezabatzeko eta birusa saihesteko.RNA degradatu egiten da.

Azido nukleikoen erauzketa lisiaren disoluzioan oinarrituta prestatutako birusen laginketa-soluzioa.Osagai nagusiak gatz orekatuak, azido etilendiaminotetraacetikoko agente kelatzailea, guanidina gatza (guanidina isotiozianatoa, guanidina klorhidratoa, etab.), tensioaktibo anionikoa (dodekanoa) sodio sulfatoa), tensioaktibo katioikoa (tetradecyl trimetil amonio oxalatoa), fenola, proteina, 8-reihidroxinotol eta beste hainbat osagai dira.Gaur egun, azido nukleikoak erauzteko kit mota asko daude, eta azido nukleikoak erauzteko eta arazteko erreaktibo desberdinak erabiltzen dira.Nahiz eta azido nukleikoen erauzketa eta arazteko erreaktibo bera erabili, kit bakoitzaren erauzketa prozedurak desberdinak dira.

Gaur egun, Produktu Medikoen Administrazio Nazionalak onartutako azido nukleikoak detektatzeko kit produktuak SARS-CoV-2 genomaren ORF1ab, E eta N geneetan oinarrituta hautatzen dira.Produktu desberdinen detekzio-printzipioak berdinak dira funtsean, baina haien abiarazleak eta zunda-diseinuak desberdinak dira.Helburu bakarreko segmentuak (ORF1ab), helburu bikoitzeko segmentuak (ORF1ab, N edo E) eta hiru helburuko segmentuak (ORF1ab, N eta E) daude.Detekzio eta interpretazioaren, azido nukleikoen erauzketa eta denbora errealeko RT-PCR erreakzio-sistema fluoreszenteen arteko desberdintasunak kitaren argibide egokiak ikusi behar ditu, eta gomendatzen da erabiltzaileek interpretatzeko kitaren argibideetan zehaztutako interpretazio-metodoa zorrotz jarraitzea.Denbora errealeko RT-PCR fluoreszentearen bidez anplifikatutako eskualde arruntak, abiarazleak eta zunda-sekuentziak P3-n erakusten dira.

P3 SARS-CoV-2 anplikoiaren xedearen kokapena genoman eta abiarazleen eta zunden sekuentzian

SARS-CoV-2 azido nukleikoaren determinazioaren emaitzen interpretazioa (Rjan-Time fluoreszente RT-PCR)

"Pneumonia Prebentzio eta Kontrolerako Plana SARS-CoV-2 Infekzioaren (Bigarren Edizioa)" lehen aldiz argitu zituen gene bakarreko anplifikazioaren emaitzak epaitzeko irizpideak:

1. Ez Ct edo Ct≥40 ez da negatiboa;

2. Ct<37 positiboa da;

3. 37-40 Ct balioa gris-eskalako eremua da.Esperimentua errepikatzea gomendatzen da.Ct<40 berregitearen emaitzak eta anplifikazio-kurbak gailur nabariak baditu, lagina positibotzat jotzen da, bestela negatiboa da».

Gidaren hirugarren edizioak eta gidaren laugarren edizioak aurreko irizpideekin jarraitu zuten.Hala ere, kit komertzialetan erabiltzen diren helburu desberdinak direla eta, aipatutako gidaren 3. edizioak ez zuen helburuen konbinazioa zehazteko irizpiderik eman, fabrikatzaileak emandako argibideak nagusituko direla azpimarratuz.Jarraibideen bosgarren ediziotik hasita, bi helburu argitu dira, batez ere epaitzen zaila den helburu bakarraren epaiketa irizpideak.Hau da, laborategiak kasu bat SARS-CoV-2 azido nukleikoen detektatzeko kasu bat positiboa dela baieztatu nahi badu, honako hauek bete behar dira bi baldintzaetatik 1:

(1) Lagin bereko SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) bi helburu positiboak dira denbora errealeko RT-PCR fluoreszentearen bidez.Helburu bakarra positiboa bada, berriro laginketa eta berriro probatu behar dira.Probaren emaitzak badira Helburu bakarra oraindik positiboa bada, positibotzat jotzen da.

(2) Denbora errealeko RT-PCR fluoreszentearen bi lagink helburu bakarra positibo bat erakutsi zuten aldi berean edo mota bereko bi laginek helburu bakarraren emaitza positiboa erakutsi zuten, positibotzat jo daitekeena.Hala ere, jarraibideek ere azpimarratzen dute azido nukleikoen proben emaitza negatiboek ezin dutela SARS-CoV-2 infekzioa baztertu.Negatibo faltsuak eragin ditzaketen faktoreak baztertu behar dira, besteak beste, laginaren kalitate eskasa (arnasketa-laginak orofaringearen eta beste atal batzuen artean), laginak biltzea goiz edo beranduegi, Laginak ez ziren behar bezala gorde, garraiatu eta prozesatu, eta teknologiak berak arazoak izan zituen (birusen aldakuntza, PCR inhibizioa), etab.

Negatibo faltsuen arrazoiak SARS-CoV-2 detektatzeko

Gaur egun azido nukleikoen probetan "negatibo faltsu" kontzeptuak "negatibo faltsuak" aipatzen ditu sarritan, azido nukleikoen probaren emaitzak agerpen klinikoekin bat ez datozenak, hau da, sintoma klinikoak eta irudien emaitzak COVID-19ren susmagarriak dira, baina azido nukleikoen probak "negatiboak" izaten dira askotan.Osasun Batzorde Nazionaleko Laborategi Kliniko Zentroak SARS-CoV-2 proba "negatibo faltsua" azaldu zuen.

(1) Kutsatutako pertsonaren zeluletan birus kopuru jakin bat dago.Dauden datuek erakusten dute gorputza birusak kutsatu ondoren, birusa sudurretik eta ahotik eztarrira sartzen dela, gero trakeara eta bronkioetara, eta gero albeoloetara iristen dela.Kutsatutako pertsonak inkubazio-aldia, sintoma arinak eta, ondoren, sintoma larrien prozesua eta gaixotasunaren fase desberdinak biziko ditu.Eta gorputzeko atal ezberdinetan dagoen birus kopurua desberdina da.

Zelula moten karga birikoari dagokionez, zelula epitelial albeolarrak (behe arnasbideak)> arnasbideetako zelula epitelialak (goi arnasbideak)> fibroblastoak, zelula endotelialak eta makrofagoak, etab.;lagin motatik, garbiketa albeolarraren likidoa (Bikainena)>eztularen esputo sakona>saburdinofaringea>laster orofaringea>odola.Gainera, birusa gorotzetan ere atzeman daiteke.Hala ere, funtzionamenduaren erosotasuna eta pazienteen onarpena kontuan hartuta, erabili ohi den lagin klinikoaren ordena orofaringea> swab nasofaringea> bronkio garbiketa fluidoa (eragiketa konplexua) eta esputo sakona (normalean eztul lehorra, lortzeko zaila) da.

Hori dela eta, gaixo batzuen orofaringe edo nasofaringearen zeluletan birus kopurua txikia edo oso txikia da.Orofaringearen edo nasofaringearen laginak bakarrik hartzen badira probarako, ez da azido nukleiko birikoa detektatuko.

(2) Laginak biltzean ez zen birusik duten zelularik bildu, edo azido nukleiko birikoa ez zen modu eraginkorrean kontserbatu.

[① Bilketa gune desegokia, adibidez, orofaringe-lapitxoak biltzen direnean, bilketa-sakonera ez da nahikoa, bildutako nasofaringe-lapitxoak ez dira sudur barrunbean sakon biltzen, etab. Bildutako zelula gehienak birusik gabeko zelulak izan daitezke;

②Laginak hartzeko laginak gaizki erabiltzen dira.Esate baterako, PE zuntza, poliester zuntza eta polipropileno zuntza bezalako zuntz sintetikoak gomendatzen dira swab-buruaren materialarentzat.Kotoia bezalako zuntz naturalak erabiltzen dira funtzionamendu errealean (proteinen xurgapen handia eta ez da erraza garbitzen) Eta nylonezko zuntzak (uraren xurgapen eskasa, laginketa bolumen nahikoa ez izatea eragiten du);

③Birusa biltegiratzeko hodien erabilera okerra, esate baterako, azido nukleikoak (DNA/RNA) xurgatzen errazak diren polipropilenozko edo polietilenozko plastikozko biltegiratze hodien erabilera okerra, eta ondorioz, biltegiratze-soluzioaren azido nukleikoaren kontzentrazioa gutxitu da.Praktikan, polietileno-propileno polimero plastikoa eta bereziki tratatutako polipropileno plastikozko ontzi batzuk erabiltzea gomendatzen da azido nukleiko birikoak gordetzeko.]

[① Bilketa gune desegokia, adibidez, orofaringe-lapitxoak biltzen direnean, bilketa-sakonera ez da nahikoa, bildutako nasofaringe-lapitxoak ez dira sudur barrunbean sakon biltzen, etab. Bildutako zelula gehienak birusik gabeko zelulak izan daitezke;

②Laginak hartzeko laginak gaizki erabiltzen dira.Esate baterako, PE zuntza, poliester zuntza eta polipropileno zuntza bezalako zuntz sintetikoak gomendatzen dira swab-buruaren materialarentzat.Kotoia bezalako zuntz naturalak erabiltzen dira funtzionamendu errealean (proteinen xurgapen handia eta ez da erraza garbitzen) Eta nylonezko zuntzak (uraren xurgapen eskasa, laginketa bolumen nahikoa ez izatea eragiten du);

③Birusa biltegiratzeko hodien erabilera okerra, esate baterako, azido nukleikoak (DNA/RNA) xurgatzen errazak diren polipropilenozko edo polietilenozko plastikozko biltegiratze hodien erabilera okerra, eta ondorioz, biltegiratze-soluzioaren azido nukleikoaren kontzentrazioa gutxitu da.Praktikan, polietileno-propileno polimero plastikoa eta bereziki tratatutako polipropileno plastikozko ontzi batzuk erabiltzea gomendatzen da azido nukleiko birikoak gordetzeko.]

(4) Laborategi klinikoko eragiketa ez dago estandarizatuta.Laginak garraiatzeko eta biltegiratzeko baldintzak, laborategi klinikoen funtzionamendu normalizatua, emaitzen interpretazioa eta kalitate-kontrola funtsezko faktoreak dira proben emaitzen zehaztasuna eta fidagarritasuna bermatzeko.Osasun Batzorde Nazionaleko Laborategi Klinikoko Zentroak 2020ko martxoaren 16tik 24an egindako kanpoko kalitate-ebaluazioaren emaitzen arabera, baliozko emaitzak jaso zituzten 844 laborategietatik 701 (%83,1) sailkatuta zeuden, eta 143 (%16,9) ez.Kalifikatuta, laborategiko proba-baldintza orokorrak onak dira, baina laborategi ezberdinek oraindik ere desberdintasunak dituzte langileen funtzionamendu-gaitasunean, helburu bakarreko lagin positiboaren interpretazio-gaitasunean eta kalitate-kontrolean.

Nola murriztu SARS-CoV-2 azido nukleikoaren detekzioaren negatibo faltsua?

Azido nukleikoen detekzioan negatibo faltsuak murriztea negatibo faltsuak sortzearen lau alderdietatik optimizatu behar da.

(1) Kutsatutako pertsonaren zeluletan birus kopuru jakin bat dago.Ustezko kutsatutako pertsonen gorputzeko atal ezberdinetan birusaren kontzentrazioa desberdina izango da une desberdinetan.Faringerik ez badago, bronkioetako garbiketa-likidoan edo gorotzetan egon daiteke.Proba egiteko hainbat lagin mota aldi berean edo gaixotasunaren progresioaren fase desberdinetan jaso badaitezke, negatibo faltsuak saihesten lagunduko du.

(2) Birusa duten zelulak bildu behar dira laginak biltzean.Arazo hau hein handi batean konpon daiteke lagin-biltzaileen prestakuntza indartuz.

(3) IVD erreaktibo fidagarriak.Nazio mailan erreaktiboen detekzio-errendimenduaren ebaluazioari buruzko ikerketak eginez eta dauden arazoak eztabaidatuz, erreaktiboen detekzio-eraginkortasuna gehiago hobetu daiteke eta analisiaren sentsibilitatea hobetu daiteke.

(4) Laborategi klinikoen funtzionamendu normalizatua.Laborategiko langileen prestakuntza indartuz, laborategiko kalitatea kudeatzeko sistema etengabe hobetuz, arrazoizko zatiketak bermatuz eta langileen detektatzeko gaitasuna hobetuz, negatibo faltsuak murriztea posible da laborategiko eragiketa desegokiengatik.

SARS-CoV-2 azido nukleikoaren proba berriro positiboa izateko arrazoiak berreskuratutako eta alta emandako pazienteetan

"COVID-19 Diagnostiko eta Tratamendu Planak (Zazpigarren Edizioa Saiakuntza)" argi eta garbi zehazten du COVID-19 gaixoak sendatu eta ospitaletik alta izateko irizpideetako bat dela ondoz ondoko bi arnasbide laginek azido nukleikoen proba negatiboa izatea (gutxienez 24 orduko tartea), baina oso gutxi daude SARS-CoV-2 pazienteak berriro ere azido nukleikoengatik positibo atera ziren hainbat arrazoirengatik.

(1) SARS-CoV-2 birus berria da.Beharrezkoa da bere mekanismo patogenoa, eragindako gaixotasunaren irudi osoa eta gaixotasunaren ibilbidearen ezaugarriak gehiago ulertzea.Horregatik, alde batetik, beharrezkoa da alta emandako pazienteen kudeaketa indartzea eta 14 eguneko behaketa medikoa egitea.Jarraipena, osasunaren jarraipena eta osasun orientazioa egitea gaixotasunaren agerraldiaren, garapenaren eta emaitzaren prozesu guztiaren ulermenean sakontzeko.

(2) Gaixoa birusarekin kutsatuta egon daiteke berriro.Zhong Nanshan akademikoak esan zuen: sendatutako pazienteek antigorputzak dituztenez, SARS-CoV-2 antigorputzek desagerrarazi dezakete berriro inbaditzen direnean.Arrazoi asko daude, berreskuratutako pazientearen kausa izan daitezkeenak, edo birusaren mutazioarekin erlazionatuta egon daitezke, edota laborategiko proben kausa.Birusa bera bada, SARS-CoV-2 mutazioak berreskuratutako pazienteak ekoitzitako antigorputza birus mutatuaren aurka eraginkorra ez izatea eragin dezake.Gaixoa birus mutatuarekin berriro kutsatzen bada, baliteke azido nukleikoaren proba berriro positiboa izatea.

(3) Laborategiko proba metodoei dagokienez, proba metodo bakoitzak bere mugak ditu.SARS-CoV-2 azido nukleikoaren detekzioa gene-sekuentzia aukeratzearen, erreaktiboen konposizioaren, metodoaren sentsibilitatearen eta beste arrazoi batzuengatik gertatzen da, lehendik dauden kitek beren detekzio-muga baxuagoak izatea eraginez.Gaixoa tratatu ondoren, gorputzeko birusa gutxitzen da.Probatu beharreko laginaren karga birikoa detekzio-muga azpitik dagoenean, emaitza "negatiboa" agertuko da.Hala ere, emaitza honek ez du esan nahi gorputzeko birusa guztiz desagertu denik.Birusa tratamendua eten ondoren egon daiteke.Berpizkundea”, kopiatzen jarraitu.Hori dela eta, astean behin berrikustea gomendatzen da alta eman eta gero 2 eta 4 asteetan.

(4) Azido nukleikoa birusaren material genetikoa da.Birusa gaixoak birusen aurkako tratamendua jasan ondoren hiltzen da, baina gainerako RNA birikoaren zatiak oraindik ere giza gorputzean mantentzen dira, eta ez dira gorputzetik guztiz deskargatzen.Batzuetan, egoera jakin batzuetan, gehiago atxiki daiteke.Denbora luzea, eta une honetan azido nukleikoen proba "iragankorra" positiboa izango da.Pazientearen berreskuratze-denbora luzatzearekin batera, gorputzeko RNA hondar zatiak pixkanaka agortu ondoren, azido nukleikoaren probaren emaitza negatiboa izan daiteke.

(5) SARS-CoV-2ren azido nukleikoaren probaren emaitzak RNA birikoaren presentzia edo eza bakarrik frogatzen du, eta ezin du birusaren jarduera eta birusa transmitigarria den frogatu.Berriro azido nukleikoen proba positiboa duen pazientea berriro infekzio iturri bihurtuko den frogatu behar da.Beharrezkoa da lagin klinikoetan birusaren hazkuntza egitea eta birus “bizia” lantzea infekziosoa dela frogatzeko.

Laburpen

Laburbilduz, ezin dira guztiz saihestu SARS-CoV-2 azido nukleikoak negatibo faltsuak, berriro proba positiboak eta adierazpen klinikoekin bat ez datozen beste baldintza batzuk.Benetako baheketa eta probetan, sintoma klinikoak, irudi-azterketak (CT) eta esperimentuak konbinatzea gomendatzen da Laborategiko proba (azido nukleikoen proba + birusaren aurkako antigorputz espezifikoen proba) emaitzak diagnostiko integrala egiteko, diagnostiko hutsa eta diagnostiko okerrak saihesteko.Proba-emaitzak agerpen klinikoekin bat datozela nabaria bada, gomendatzen da probaren esteka osoaren azterketa integrala egitea (laginak biltzea, zirkulazioa eta prozesatzeko estekak) SARS-CoV-2 birusaren infekzio goiztiarra, infekzio errepikakorra edo arnas birusen beste infekzio batzuekin konbinatuta, etab.Baldintzek ahalbidetzen badute, lagin sentikorragoak biltzea gomendatzen da, esate baterako, esputoa edo garbiketa albeolarraren fluidoa berriro aztertzeko.

Erlazionatutako produktuak:

SARS-CoV-2 azido nukleikoa detektatzeko kit (PCR multiplexaren zunda fluoreszentearen metodoa)