PCR erreaktiboen hasierako fasean abiarazleen eta zunden errendimendua egiaztatzea eta erreakzio-baldintza egokienak zehaztea dira esperimentu formalen aurrerapen egokia bermatzeko ezinbesteko baldintzak.
Beraz, nola baieztatu behar dugu hasierako zunda hasierako fasean?
Adierazle nagusiak oinarrizko lerroa, anplifikazio-kurba, ct balioa, anplifikazio-eraginkortasuna, kontzentrazio baxuko laginaren detekzioa, CV, etab.
Oinarrizko lerroa
Oinarrizko lerroa PCR anplifikazio-kurbaren lerro horizontala da.PCR anplifikazio-erreakzioaren lehen zikloetan, fluoreszentzia-seinalea ez da asko aldatzen eta lerro zuzen bat osatzen du.Lerro zuzen hau oinarri-lerroa da.
PCR hasierako zundak aztertzerakoan, arreta jarri oinarri-lerroa berdina den ala ez.Primer-zundaren kontzentrazio-garbitasunak oinarri-lerroari eragingo dio, esate baterako, oinarri-lerroa igo edo jaitsi egingo da.Oinarrizko lerroa ere oso adierazle intuitiboa da.
Anplifikazio Kurba
Beste adierazle intuitibo bat anplifikazio-kurbaren forma da.Hobe da S formako kurba bat izatea bigarren mailako anplifikazioa edo beste anplifikazio kurba anormalak saihesteko.
Ct balioa
Oinarrizko lerrotik hazkunde esponentzialerako inflexio puntuari dagokion ziklo kopurua Ct balioa da.
Lagin berarentzat, lehen zunda ezberdinek anplifikazio-kurba desberdinak sortzen dituzte, eta dagokion Ct balioa anplifikazio-eraginkortasunak eta interferentzia-mailak eragingo du.Teorian, aukeratzen dugun lehen zundaren Ct balioa zenbat eta txikiagoa izan, orduan eta hobeto.
Anplifikazio-eraginkortasuna
PCR anplifikazioaren eraginkortasuna ebaluatzeko metodo fidagarri eta egonkorrenetako bat kurba estandarra da, ikertzaileek ere oso ezaguna dena.Metodoak helburu-txantiloien kopuru erlatiboa kontrolatzeko lagin sorta bat egitean datza.Lagin hauek stock kontzentratuen disoluzio serieen bidez egin ohi dira, gehien erabiltzen dena 10 aldiz diluzioa da.Diluitutako lagin sorta bat erabiliz, qPCR programa estandarra erabiliz anplifikatzeko Cq balioa lortzeko, eta, azkenik, kurba estandar bat marraztu lagin bakoitzaren kontzentrazioa eta dagokion Cq balioaren arabera Cq= -klgX0+b ekuazio lineala lortzeko, eta anplifikazio-eraginkortasuna E=10(-1 /k)-1 lortzeko.Analisi kuantitatiborako qPCR erabiltzean, anplifikazio-eraginkortasuna %90-%110 bitartekoa izan behar da (3,6>k>3,1).
Kontzentrazio baxuko laginak hautematea
Laginaren kontzentrazioa txikia denean, hasierako zunda ezberdinen detekzio-tasa desberdinak dira.Erreplikatzeko kontzentrazio baxuko 20 lagin hautatzen ditugu, eta detekzio-tasa handiena duen primer-zunda sistema da onena.
Aldakuntza-koefizientea (CV)
10 lagin bikoiztu detektatu daitezke azido nukleikoaren anplifikazioa detektatzeko erreaktiboaren lerro estandarraren arabera, abiarazte-zunda ezberdinekin.
Erreaktibo kuantitatiboak:
Zehaztasuna
Lote bateko zehaztasunak bete behar du: probako kontzentrazioaren balio logaritmikoaren aldakuntza-koefizientea (CV,%) % 5 da.Laginaren kontzentrazioa baxua denean, detekzio-kontzentrazioko logaritmoaren aldakuntza-koefizientea (CV,%) ≤% 10 da.
Erreaktibo kualitatiboak:
Zehaztasuna
Lote bateko zehaztasunak bete behar ditu:
(1) Ct balioaren aldakuntza-koefizientea (CV,%) ≤%5
Lagin bera paraleloan 10 aldiz probatzen da, eta probaren emaitzak koherenteak izan behar dira
Argitalpenaren ordua: 2021-09-18
