• facebook
  • linkedin
  • youtube

 Fluoreszentzia-PCR kuantitatiboa (TaqMan PCR izenez ere ezaguna, aurrerantzean FQ-PCR deitzen dena) PEk (Perkin Elmer-ek) Estatu Batuetan 1995ean garatutako azido nukleiko kuantitatiboko teknologia berria da. Teknologia hau PCR konbentzionalean oinarritzen da, etiketa fluoreszentedun zundak gehituz.PCR malguarekin alderatuta, FQ-PCR-k abantaila asko ditu bere funtzio kuantitatiboa gauzatzeko.Artikulu honek teknologiaren ezaugarriak, printzipioak, metodoak eta aplikazioak labur deskribatu nahi ditu.

1 Ezaugarriak

FQ-PCR-k PCR arruntaren sentsibilitate handia izateaz gain, zunda fluoreszenteen aplikazioa dela eta, zuzenean antzeman dezake seinale fluoreszentearen aldaketa PCR anplifikazioan zehar kondukzio fotoelektrikoaren sistemaren bidez emaitza kuantitatiboak lortzeko, eta horrek PCR konbentzionalen gabezia asko gainditzen ditu, beraz, DNA hibridazioaren espezifikotasun handia eta espektroskopioaren zehaztasun teknologia ere baditu.

Esate baterako, PCR produktu orokorrak agarosa gel elektroforesiaren eta etidio bromuroaren tindaketa argi ultramorearekin edo poliakrilamida gel elektroforesiaren bidez eta zilarrezko tindaketaren bidez ikusi behar dira.Honek tresna anitz behar izateaz gain, denbora eta ahalegina ere eskatzen ditu.Erabilitako etidio bromuroak kaltegarriak dira giza gorputzarentzat, eta prozedura esperimental korapilatsu hauek kutsadura eta positibo faltsuak izateko aukerak ematen dituzte.Hala ere, FQ-PCR-k estalkia behin bakarrik ireki behar du laginak kargatzean, eta ondorengo prozesua hodi itxiko funtzionamendua da, eta horrek ez du PCR post-prozesatu behar, PCR ohiko eragiketetan eragozpen asko saihestuz.Esperimentuak, oro har, PE enpresak garatutako ABI7100 PCR ziklogailu termikoa erabiltzen du.

Tresnak ezaugarri hauek ditu: ① Aplikazio zabala: DNA eta RNA PCR produktuen kuantifikaziorako, gene espresioaren ikerketarako, patogenoen detekziorako eta PCR baldintzen optimizaziorako erabil daiteke.② Printzipio kuantitatibo bakarra: fluoreszentez etiketatutako zundak erabiliz, fluoreszentzia kopurua PCR zikloarekin pilatuko da laser kitzikapenaren ondoren, kuantifikazioaren helburua lortzeko.③ Lan-eraginkortasun handia: 9600 PCR ziklogailu termikoa integratua, 1 eta 2 orduz ordenagailuz kontrolatua 96 laginen anplifikazioa eta kuantifikazioa automatikoki eta sinkronoki osatzeko.④ Ez da gel elektroforesirik behar: ez da lagina diluitu eta elektroforesi egin beharrik, erabili zunda berezi bat zuzenean erreakzio-hodian detektatzeko.⑤Kutsadurarik ez kanalizazioan: guztiz itxitako erreakzio-hodi paregabea eta kondukzio fotoelektrikoko sistema onartzen dira, beraz, ez dago kutsaduraz kezkatu beharrik.⑥Emaitzak errepikagarriak dira: barruti dinamiko kuantitatiboa bost magnitude ordenakoa da.Hori dela eta, teknologia hau arrakastaz garatu denez, ikertzaile zientifiko askok baloratu dute eta alor askotan aplikatu dute.

2 Printzipioak eta metodoak

FQ-PCRren funtzionamendu-printzipioa Taq entzimaren 5′→3′ exonukleasa jarduera erabiltzea da, fluoreszentez markatutako zunda bat PCR erreakzio sisteman gehitzeko.Zunda abiarazte-sekuentzian dagoen DNA txantiloiarekin hibridatu daiteke zehazki.Zundaren 5'muturra FAM fluoreszentzia-igorpen genearekin (6-karboxifluoreszeina, fluoreszentzia-igorpenaren gailurra 518 nm-tan) etiketatuta dago eta 3' muturra TAMRA (6-karboxitetrametilrodamina, fluoreszentzia-igorpenaren gailurra da fluoreszentzia-igorpena) PCR anplifikazioan zunda luzatzea eragotzi.Zunda osorik geratzen denean, kencher-taldeak igorle taldearen fluoreszentzia-igorpena kentzen du.Talde igorlea itzaltzeko taldetik bereizten denean, inhibizioa altxatu egiten da, eta 518 nm-ko dentsitate optikoa handitu eta fluoreszentzia detektatzeko sistemak detektatzen du.Bernaturazio fasean, zunda DNA txantiloiarekin hibridatzen da, eta luzapen-fasean Taq entzima DNA txantiloian zehar mugitzen da abiaraztearen luzapenarekin.Zunda mozten denean, itzaltze-efektua askatzen da eta seinale fluoreszentea askatzen da.Txantiloia kopiatzen den bakoitzean, zunda bat mozten da, seinale fluoreszente bat askatzearekin batera.Askatutako fluoroforo kopuruaren eta PCR produktuen kopuruaren artean bat-bateko erlazioa dagoenez, teknika hau txantiloia zehaztasunez kuantifikatzeko erabil daiteke.Tresna esperimentalak, oro har, PE enpresak garatutako ABI7100 PCR ziklogailu termikoa erabiltzen du, eta beste ziklogailu termiko batzuk ere erabil daitezke.Esperimenturako ABI7700 erreakzio motako erreakzio sistema erabiltzen bada, erreakzioa amaitu ondoren, emaitza kuantitatiboak zuzenean eman daitezke ordenagailuaren analisiaren bidez.Beste ziklogailu termiko batzuk erabiltzen badituzu, fluoreszentzia-detektagailu bat erabili behar duzu erreakzio-hodian fluoreszentzia seinalea neurtzeko aldi berean RQ+, RQ-, △RQ kalkulatzeko.RQ+ lagin-hodiaren igorpen-talde fluoreszentearen lumineszentzia-intentsitatearen eta itzaltze-taldearen lumineszentzia-intentsitatearen erlazioa adierazten du, RQ-k hodi hutsean dauden bien arteko erlazioa adierazten du, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) PCR-an fluoreszentzia-seinalearen aldaketaren zenbatekoa adierazten du, datu kuantitatiboak prozesatu ondoren.Zunda fluoreszenteak sartu direnez, esperimentuaren espezifikotasuna nabarmen hobetzen da.Zundaren diseinuak, oro har, baldintza hauek bete behar ditu: ①Zundaren luzerak 20-40 base ingurukoa izan behar du, loturaren espezifikotasuna ziurtatzeko.② GC baseen edukia % 40 eta % 60 artekoa da nukleotido bakarren sekuentziak bikoiztea ekiditeko.③ Saihestu hibridazioa edo lehengaiekin gainjartzea.④ Zundaren eta txantiloiaren arteko loturaren egonkortasuna abiarazlearen eta txantiloiaren arteko loturaren egonkortasuna baino handiagoa da, beraz, zundaren Tm balioa hasierako Tm balioa baino gutxienez 5 °C handiagoa izan behar du.Horrez gain, zundaren kontzentrazioa, zundaren eta txantiloi-sekuentziaren arteko homologiak eta zunda eta abiaraztearen arteko distantziak eragina dute emaitza esperimentaletan.

Erlazionatutako produktuak:

Txina Lnc-RT Heroᵀᴹ I (gDNasarekin) (lncRNAren lehen katearen cDNA sintesirako Super Premix) Fabrikatzailea eta Hornitzailea |Foregene (foreivd.com)

Txinako denbora errealeko PCR Easyᵀᴹ-Taqman fabrikatzailea eta hornitzailea |Foregene (foreivd.com)


Argitalpenaren ordua: 2021-10-15