Diagnostiko molekularraren teknologiak biologia molekularreko metodoak erabiltzen ditu giza gorputzaren material genetikoaren adierazpena eta egitura eta hainbat patogeno detektatzeko, gaixotasunak aurreikusteko eta diagnostikatzeko helburua lortzeko.

Azken urteotan, diagnostiko molekularren teknologia berritu eta errepikatu ahala, diagnostiko molekularren aplikazio klinikoa gero eta zabalagoa eta sakonagoa izan da, eta diagnostiko molekularren merkatua garapen azkarrean sartu da.

Egileak merkatuan dauden diagnostiko molekular ohiko teknologiak laburbiltzen ditu, eta hiru zatitan banatuta dago: lehenengo zatian PCR teknologia aurkezten du, bigarren zatian azido nukleikoen anplifikazio isotermikoen teknologia eta bigarren zatian sekuentziazio teknologia aurkezten da.

01

I. zatia: PCR Teknologia

PCR teknologia

PCR (polymerase chain reaction) in vitro DNA anplifikatzeko teknologietako bat da, 30 urte baino gehiagoko historia duena.

PCR teknologia 1983an aitzindaria izan zen AEBko Cetus-eko Kary Mullis-ek.Mullis-ek PCR patente bat eskatu zuen 1985ean eta urte berean argitaratu zuen Zientziari buruzko lehen PCR lan akademikoa.Mullis-ek Kimikako Nobel Saria irabazi zuen 1993an.

PCRren oinarrizko printzipioak

PCR-k helburuko DNA zatiak milioi bat aldiz baino gehiago handitu ditzake.Printzipioa hauxe da: DNA polimerasaren katalisiaren azpian, ama-katearen DNA txantiloi gisa erabiltzen dela eta abiarazte zehatz bat luzapenerako abiapuntu gisa.In vitro errepikatzen da desnaturalizazioa, annealing eta luzapena bezalako urratsen bidez.Kate alabaren DNAren prozesu nagusia katearen txantiloiaren DNAren osagarria.

PCR prozesu estandarra hiru urratsetan banatzen da:

1. Desnaturalizazioa: Tenperatura altua erabili DNA kate bikoitzak bereizteko.DNA kate bikoitzen arteko hidrogeno-loturak hausten dira tenperatura altuetan (93-98 °C).

2. Erretiroa: kate bikoitzeko DNA banandu ondoren, tenperatura jaisten da, abiarazlea kate bakarreko DNAri lotu ahal izateko.

3. Hedapena: DNA polimerasa hari osagarriak sintetizatzen hasten da DNA kateetan zehar loturiko abiarazteetatik tenperatura jaisten denean.Luzapena amaitzen denean, ziklo bat osatzen da, eta DNA zatien kopurua bikoiztu egiten da.

Hiru urrats hauek 25-35 aldiz errepikatuz, DNA zatien kopurua esponentzialki handituko da.

PCRren asmamena zera da: abiarazle desberdinak xede-gene desberdinetarako diseina daitezkeela da, xede-gene-zatiak denbora-tarte laburrean anplifikatu ahal izateko.

Orain arte, PCR hiru kategoriatan bana daiteke, hots, PCR arrunta, PCR kuantitatibo fluoreszentea eta PCR digitala.

PCR arruntaren lehen belaunaldia

Erabili PCR anplifikazio tresna arrunt bat xede genea anplifikatzeko, eta, ondoren, erabili agarosa gel elektroforesia produktua detektatzeko, analisi kualitatiboa bakarrik egin daiteke.

Lehen belaunaldiko PCRren desabantaila nagusiak:

-Anplifikazio ez-espezifikoa eta emaitza positibo faltsuak izateko joera.

-Detekzioak denbora luzea hartzen du eta eragiketa astuna da.

-Saiakuntza kualitatiboak soilik egin daitezke.

Bigarren belaunaldiko fluoreszentzia PCR kuantitatiboa

Fluoreszentzia-PCR kuantitatiboa (Real-Time PCR), qPCR izenez ere ezaguna, seinale fluoreszenteen metaketaren bidez anplifikatutako produktuen pilaketa kontrolatzeko erabiltzen da, erreakzio-sistemaren aurrerapena adieraz dezaketen zunda fluoreszenteak gehituz, eta emaitzak fluoreszentzia-kurbaren bidez epaitzeko, eta Cq balioaren eta kurba estandarraren laguntzaz kuantifikatu daiteke.

qPCR teknologia sistema itxi batean egiten denez, kutsatzeko probabilitatea murrizten da, eta fluoreszentzia seinalea detekzio kuantitatiboan kontrolatu daiteke, beraz, praktika klinikoan gehien erabiltzen dena da eta PCRn teknologia nagusi bihurtu da.

Denbora errealeko PCR kuantitatibo fluoreszenteetan erabiltzen diren substantzia fluoreszenteak honako hauetan bana daitezke: TaqMan zunda fluoreszenteak, baliza molekularrak eta koloratzaile fluoreszenteak.

1) TaqMan zunda fluoreszentea:

PCR anplifikazioan, zunda fluoreszente espezifiko bat gehitzen da lehen pare bat gehitzen den bitartean.Zunda oligonukleotido bat da, eta bi muturrak talde fluoreszente berritzaile batekin eta talde fluoreszente itzaltzaile batekin markatuta daude.

Zunda osorik dagoenean, erreportari-taldeak igorritako seinale fluoreszentea itzaltze-taldeak xurgatzen du;PCR anplifikazioan, Taq entzimaren 5′-3′ exonukleasa jarduerak zunda mozten eta degradatzen du, talde fluoreszente berriemailea eta itzaltzailea eginez. PCR produktua.

2) SYBR koloratzaile fluoreszenteak:

PCR erreakzio sisteman, SYBR koloratzaile fluoreszentearen gehiegizko bat gehitzen da.SYBR koloratzaile fluoreszentea DNA kate bikoitzean ez-espezifikoki sartu ondoren, seinale fluoreszente bat igortzen du.Katean sartzen ez den SYBR koloratzaile molekulak ez du seinale fluoreszenterik igorriko, eta horrela seinale fluoreszentea ziurtatzen du PCR produktuen hazkundea PCR produktuen gehikuntzarekin guztiz sinkronizatuta dago.SYBR kate bikoitzeko DNArekin soilik lotzen da, beraz, urtze-kurba erabil daiteke PCR erreakzioa espezifikoa den zehazteko.

3) Baliza molekularrak

Zurtoin-begizta etiketa bikoitzeko oligonukleotido zunda bat da, 5 eta 3 muturretan 8 base inguruko ile-egitura bat osatzen duena.Bi muturretako azido nukleikoen sekuentziak osagarri parekatuta daude, talde fluoreszentea eta itzaltze taldea estuak izatea eraginez.Itxi, ez du fluoreszentziarik sortuko.

PCR produktua sortu ondoren, annealing-prozesuan, baliza molekularraren erdiko zatia DNA sekuentzia zehatz batekin parekatzen da, eta gene fluoreszentea kencher genetik bereizten da fluoreszentzia sortzeko.

Bigarren belaunaldiko PCRren desabantaila nagusiak:

Sentikortasuna falta da oraindik, eta kopia gutxiko aleak hautematea ez da zehatza.

Atzeko balioaren eragina dago, eta emaitza interferentziak jasan ditzake.

Hirugarren belaunaldiko PCR digitala

PCR digitalak (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) xede-sekuentziaren kopia-zenbakia kalkulatzen du amaierako detekzio bidez, eta detekzio kuantitatibo absolutu zehatza egin dezake barne-kontrolak eta kurba estandarrak erabili gabe.

PCR digitalak amaierako detekzioa erabiltzen du eta ez dago Ct balioaren (zikloaren atalasea) araberakoa, beraz, PCR digitalaren erreakzioa anplifikazio-eraginkortasunak gutxiago eragiten du eta PCR erreakzioaren inhibitzaileekiko tolerantzia hobetzen da, zehaztasun eta erreproduzigarritasun handiarekin.

Sentikortasun handiko eta zehaztasun handiko ezaugarriak direla eta, PCR erreakzio inhibitzaileek ez dute erraz interferentziarik eragiten, eta benetako kuantifikazio absolutua lor dezake produktu estandarrik gabe, ikerketa eta aplikazio gune bihurtu dena.

Erreakzio-unitatearen forma ezberdinen arabera, hiru motatan bana daiteke: mikrofluidikoak, txip eta tanta-sistemak.