• facebook
  • linkedin
  • youtube

1. ARN disoluzioaren xurgapena detektatu

280, 320, 230 eta 260 nm-ko absorbantziak azido nukleikoaren, hondoaren (disoluzioaren uhertasuna), gatz-kontzentrazioa eta proteina bezalako materia organikoaren balioak adierazten ditu, hurrenez hurren.Orokorrean, soilik begiratu OD260/OD280 (Ratioa, R).1.8 ~ 2.0 denean, uste dugu RNAn proteina edo beste materia organikoen kutsadura jasan daitekeela, baina kontuan izan behar da Tris xurgapena detektatzeko buffer gisa erabiltzen denean, R balioa 2 baino handiagoa izan daitekeela (oro har <2,2 izan beharko luke).R<1,8 denean, disoluzioaren proteinen edo beste materia organikoen kutsadura nabariagoa da, eta beharren arabera zehaztu daiteke RNAren patua.R> 2,2 denean, RNA azido nukleiko bakar batean hidrolizatu dela esan nahi du.
 
2.RNAren eredu elektroforetikoa
Orokorrean, RNA elektroforesirako gel desnaturalizatzailea erabiltzen da, baina RNAren kalitatea detektatzeko soilik bada, gel desnaturalizatzailea ez da beharrezkoa, eta agarosa gel arrunta erabil daiteke.Elektroforesiaren helburua 28S eta 18S banden osotasuna eta haien erlazioa edo mRNA lohituaren osotasuna detektatzea da.Orokorrean, 28S eta 18S bandak distiratsuak, argiak eta zorrotzak badira (banden ertzak aipatzean argiak dira), eta 28S-ren distira 18S bandaren bikoitza baino gehiago bada, RNAren kalitatea ona dela uste dugu.
Aurrekoak normalean erabiltzen ditugun bi metodoak dira, baina bi metodo hauetako batek ere ezin digu argi eta garbi esan RNA disoluzioan RNasa hondarrik dagoen ala ez.Disoluzioan RNasa kopuru oso txikia badago, zaila egiten zaigu goiko metodoarekin detektatzea, baina ondorengo erreakzio entzimatiko gehienak 37 gradutik gora eta denbora luzez egiten dira.Modu honetan, RNA disoluzioan RNasa kopuru oso txikia baldin badago, orduan oso ingurune eta denbora egokia egongo da ondorengo esperimentuetan euren papera betetzeko, eta, noski, esperimentua hotza izango da une honetan.Jarraian, RNA disoluzioan RNasa hondarrik dagoen ala ez baiezta dezakeen metodo bat aurkezten dugu.
 
3. Beroa kontserbatzeko proba
Laginaren kontzentrazioaren arabera, atera 1000 ng-ko bi RNA RNA disoluziotik eta gehitu 0,5 ml-ko zentrifugatzaile-hodi batera, eta osagarri pH 7,0 Tris tamponarekin 10 ul-ko bolumen guztira, eta ondoren itxi hodiaren tapa.Jarri horietako bat tenperatura konstantean 70 °C-ko bainu-marian eta mantendu epela ordu 1ez.Beste zatia -20 °C hozkailuan gorde zen ordubetez.Denbora igarotakoan, kendu bi laginak elektroforesirako.Elektroforesia amaitu ondoren, alderatu bien banda elektroforetikoak.Bien bandak koherenteak badira edo alde nabarmenik ez badute (noski, haien bandek ere 2. metodoko baldintzak betetzen dituzte), esan nahi du ez dagoela hondar RNasa kutsadurarik RNA disoluzioan, eta RNAren kalitatea oso ona da.Aitzitik, 70°C-tan inkubatutako laginak degradazio nabaria badu, RNA disoluzioan RNasa kutsadura dagoela adierazten du.
 
2 ARNa erauzteko metodo eta teknika esperimentalak
RNA erauztean askotan aurkitzen ditugun arazoak hauek dira: (1) RNA etekina txikia da;(2) RNAk gatz kutsadura larria du;(3) RNAk disolbatzaile organikoen kutsadura larria du;(4) laginaren degradazioa eta beste arazo batzuk
 
1. Gehien erabiltzen diren RNA osoa erauzteko erreaktiboak
Guanidina isotiozianatoaren metodoa eta Trizol metodoa dira animalia-ehunetatik eta animalia-zeluletatik RNA osoa erauzteko metodorik erabilienak.Bereziki aproposa da erauzten zailak diren lagin eta ehun txikietarako, hala nola, untxiaren azaletik eta animalien ehun konektibotik RNA osoa ateratzeko;gainera, Trizol, erabilera orokorreko lisi erreaktibo gisa, landare-ehunak, bakterioak, onddoak eta beste ehunak erauzteko ere erabil daiteke.Polisakaridoak eta polifenolak dituzten landare-ehunetarako, hala nola camelia oleifera, te hostoak, koltza, etab., CTAB metodoa ere erabil daiteke RNA osoa ateratzeko.

Metodo konbentzional gisa, zutabe bikoitzeko metodoa ere oso ezaguna da bere tenperatura normalaren funtzionamenduagatik, RNasa gehitu beharrik eta segurtasunagatik: ez dago kloroformorik, fenolik eta erauzketarako beste erreaktibo organikorik.(gomendatutako produktuak )

1
2

2. Animalien ehunetatik RNA osoa erauztea
 
(1) Saiatu ehun freskoa aukeratzen, freskoa ez bada (ahal bada, hiru hilabeteko epean - 80 ℃ hozkailuan edo nitrogeno likidoan izoztuta. Ehuna moztean, ez moztu zuzenean giro-tenperaturan, ziurtatu izotz-kutxan jarri, saiatu behin eta berriz izoztea eta desizoztea saihesten.
(2) Erabili guraizeak eta pintzak garbiak ehun zati txiki bat mozteko, saiatu ehunaren erdiko zatia mozten lagina mozten duzunean, edo lehenik ehun zati handia erditik moztu eta, ondoren, moztu lagina ebaki posizio berrian.Kendutako ehuna guztiz birrindu behar da, birrindutako ehuna RNasarik gabeko EP hodi batean sartu, lisatua gehitu, birrindutako ehuna lisatua guztiz jasan behar da eta homogeneizatzeko prestatu.

(3) Ehun normaletarako, hautatu mungo babarrunaren tamainako ehunak (30-60 mg) homogeneizatzeko.Ehunek proteina, gantz edo zuntz-ehun trinko kopuru handia badute, hala nola gibela, ebakitako ehunen kopurua egoki handitu edo txikitu (aukerakoa) Aukeratu 10 ~ 20 mg).
(4) Arrainen giharrak, ganbak haragia, medusak eta ur eduki handia duten beste ehun batzuk ateratzen badira, laginaren bolumena behar bezala handitu behar da (100-200 mg gomendatzen da).
(5) Baldintzek ahalbidetzen badute, animalia-ehuna zuzenean atera daiteke pasabide handiko ehun-homogeneizatzaile batekin homogeneizatu ondoren, halako ekipamendurik ez badago.
(6) Azken erauzketaren ondoren lortutako RNA izotz-kutxan jarri behar da berehala RNAren degradazioa murrizteko.

3. Animalien zelulen RNA erauztea

(1) Esekidura-zelulak: zentrifugatu zuzenean eta baztertu euskarria, garbitu PBS antzuarekin 1-2 aldiz, gero eseki PBS kopuru egoki batekin eta, ondoren, lisatua gehitu.Ez gehitu lisatua zuzenean prezipitatutako zeluletan likidoa guztiz baztertu ondoren.Honek kanpoko geruzan lisatutako zelulen ondoren askatzen den histona paketea prezipitatutako zelulen kanpoaldera atxikitzea eragingo du, eta, ondorioz, pellet barruko zelulek lisatuarekin duten kontaktua mugatuko du., zelulen lisi osatugabea eta RNA etekin murriztea eraginez.

(2) Erdi atxikiak diren edo estuki atxikitzen ez diren zelulak: euskarria baztertu ondoren, garbitu PBSrekin 1-2 aldiz, ondoren zuzenean xurgatu PBS kantitate egokia eta putz egin laborantza-platera pipeta edo pistola batekin zelulak lehertzeko, eta transferitu RNA gabeko zeluletara.Gehitu lisatua entzimaren EP hodira erauzteko.

(3) Zelula atxikiak: lehenengo tripsinarekin digeritu behar dira, ondoren RNasarik gabeko EP hodietan bildu, gainnadantea kentzeko zentrifugatu, 1-2 aldiz PBSarekin garbitu gehiegizko tripsina kentzeko, eta PBS kopuru egoki batekin berriro esekitu. Ondoren, erauzketa urratsera jarraitu.

4. Landareen RNA erauztea

Landare-ehunak konposatu fenolikoetan aberatsak dira, edo polisakaridoetan aberatsak dira, edo identifikatu gabeko metabolito sekundario batzuk dituzte, edo RNasaren jarduera handia dute.Substantzia hauek RNArekin estuki konbinatzen dira zelulen lisiaren ondoren, konplexu disolbaezinak edo hauspeakada koloidalak eratzeko, eta horiek kentzen zailak dira.Horregatik, landare-ehuna ateratzen dugunean, landareentzako kit bat aukeratu behar dugu.Kitaren lisadoak polifenolen oxidazio erraza eta konposatu polisakaridoak eta azido nukleikoak bereizteko arazoak modu eraginkorrean konpon ditzake.

(Polisakarido polifenol landarearen RNA erauzteko, gomendatutako produktuak:

(1) Landarearen azala, mamia, haziak, hostoak eta abar mortero batean ehotu behar dira.Artezketa prozesuan, nitrogeno likidoa garaiz bete behar da lagina urtzea ekiditeko.Beheko lagina azkar gehitu behar zaio lisatuari eta astindu RNA degradatzea ekiditeko.

(2) Zuntz aberatsak diren laginetarako, hala nola arroza eta gari hostoetarako, erauzketa-kopurua behar bezala murriztu behar da, bestela ehunen artezketa eta lisia ez dira osatuko, eta ondorioz, ateratako RNA-ren etekin txikia izango da.

(3) Ur-eduki handia duten landare-ehunetarako, hala nola granada-fruta, sandia-fruta, mertxika-fruta, etab., laginaren tamaina behar bezala handitu behar da (100-200 mg aukerakoa da).

(4) Landare-ehunak, hala nola, landareen hostoak, errizomak, fruitu gogorrak eta beste material batzuk, oro har, nitrogeno likidoa erabiltzea gomendatzen da osagaiak mortero batean ondo morteatzeko eta, ondoren, erauzketa urratsera jarraitzea.Baliteke ohiko ehun homogeneizatzaileak ez izatea eraginkorrak landare-ehunak homogeneizatzeko, eta, oro har, ez dira gomendagarriak.

5. RNA erauzteko neurriak

(1) Ehun-laginak ahalik eta freskoenak izan behar dira behin eta berriz izozteak eta desizozteak saihesteko.

(2) Erauzketan ehuna guztiz lurtatu behar da, eta ehun-kopurua ez da oso txikia izan behar, are gutxiago gehiegi.

(3) Lisatua gehitu ondoren inkubazio denbora nahikoa eman behar da lagina guztiz lizatzeko.

(4) Erauzketarako Trizol metodoa erabiltzean, estratifikazioaren ondoren gainditzailea xurgatzeko printzipioa "gutxiago arnastea baino gehiago arnastea" da, eta ez da erdiko geruzara atera behar, bestela DNA genomikoaren kutsadura larria eragingo du.

(5) Garbitzean, garbiketa-likidoa hodiaren hormaren inguruan guztiz infiltratu behar da garbiketa sakona bermatzeko.

(6) Zutabea erauzteko metodorako, garbitu ondoren zutabea kentzeaz gain, adsortzio-zutabea ere banku ultra-garbi batean jarri eta 5-10 minutuz putz egin behar da disolbatzaile organikoa guztiz lurruntzeko.

(7) Zutabe-metodoaren azken eluzioan, DEPC ura gehitu ondoren, 3-5 minutuz inkubatu behar da, edo DEPC ura aldez aurretik 60 °C-ra berotu behar da eluzioaren etekina handitzeko.Trizol zatiketa eta isopropanolaren prezipitazio metodo tradizionalean, azken RNA DEPC uretan disolbatzen da, beraz, denbora egokia eman behar da disolbatzeko, eta zentrifugatzailearen hodiaren hondoa pipeta-puntarekin etengabe putz egin behar da.

3 Themen ARN kontzentrazio baxuaren/kalitate eskasaren arrazoiak eta irtenbideak
 
1. Etekina baxuegia da
Erauzitako lagina baxuegia da, kopuru osoa nahikoa ez da edo ateratako lagina gehiegizkoa da eta lisisa ez da osatu;erauzketarako kalitate egokiko ehuna edo zelulak erabili behar dira, laginaren aurretratamendua ondo egin behar da eta lisiak nahikoa izan behar du.
 
2. Genomaren hondakinak
Trizol metodoaren bidez ateratzen denean, gainnadantea geruzaren ondoren erdiko geruzara xurgatzen denean, genomaren kutsadura larria eragingo da;geruzak jartzean arreta berezia jarri behar da erdiko geruza zurrupatu ez dadin.Zutabe-metodoa erauzketarako erabiltzen bada, DNasa I duen kit bat hauta daiteke erauzteko.Mintzean xurgatutako azido nukleikoa I DNasarekin digeritzen da zuzenean, eta horrek asko murriztu ditzake DNA-hondarrak.
 
3. RNA degradazioa
Ateratako laginaren degradazioa bera izan daiteke, edo erauzketa prozesuan eragindako degradazioa;ahal den neurrian, ARNa ateratzeko lagin freskoak erabili behar dira, eta jasotako laginak nitrogeno likidoan edo -80 °C hozkailuan gorde behar dira denboran, eta behin eta berriz izoztea eta desizoztea saihestu behar da.ARNa erauzteko prozesuan RNasa/DNasarik gabeko puntak, zentrifuga-hodiak eta beste material batzuk erabili behar dira.Erauzketa prozesua ahalik eta azkarrena izan behar da.Ateratako RNA izotz-kutxa batean jarri eta -80-tan gorde behar da denboran.Erauzitako RNA gel-elektroforesiaren bidez detektatu behar bada, elektroforesia egin behar da atera eta berehala, eta elektroforesi-buffer-a prestatu berri den batekin ordezkatu behar da.
 
4. Gatza eta disolbatzaile organikoen hondakinak
Erauzketa-erreaktiboek fenola eta guanidina gatzak dituzte, eta garbiketa-soluzioak etanola.Erauzketa-prozesuan, lisatua ez zen guztiz xurgatu eta baztertu, eta garbiketa-soluzioa ez zen guztiz lehortu.Hondar-gatzak eta disolbatzaile organikoak kaltegarriak dira ondorengo alderantzizko transkripziorako eta PCRrako.Inhibizio maila desberdinak, beraz, ehun lisatua guztiz kendu behar da erauzketa prozesuan, eta garbiketa nahikoa izan behar da hodiaren inguruko hormak garbitu ahal izateko.Horrez gain, hodia hustu eta putz egin behar den urratsa da, eta horrek are gehiago murriztuko du materia organikoaren hondakina.
 
RNA erauzketari buruzko informazio gehiago lortzeko, jarraitu gure webgunea:
www.foreivd.com informazio gehiago lortzeko.

7

Argitalpenaren ordua: 2022-12-01