COVID-19 2. motako koronabirusaren arnas sindrome akutu larriak eragindako gaixotasun infekziosoa da. Pertsona bat kutsatuta dagoenean, sintoma ohikoenak sukarra, eztula eta arnas eskasa dira.

Azterketarako erabilitako laginak nasofaringe-lasterren bidez edo orofaringe-lasterren bidez jaso daitezke.

Zer da PCR?

Koronavirusak detektatzeko metodo estandarra polimerasaren kate-erreakzioa da, PCR.Biologia molekularrean oso erabilia den metodoa da.Azkar kopiatu ditzake milioika milioika DNA zati zehatzetara.

Koronabirus berriak kate bakarreko RNA genoma oso luzea du.Birus hauek PCR bidez detektatzeko, RNA molekulak beren DNA sekuentzia osagarrietan bihurtu behar dira alderantzizko transkriptasa bidez, eta, ondoren, sintetizatu berria den DNA PCR prozedura estandarren bidez anplifikatu daiteke, normalean RT-PCR izenez ezagutzen dena.

RT-PCR prozesua

RNA erauzketa

Metodo hau egiteko, funtsean, RNA birikoa atera behar da.Hainbat RNA arazteko kit erabil daitezke bereizketa eroso, azkar eta eraginkorra lortzeko.

RNA birikoa ateratzeko kit komertzial baten bidez, gehitu lagina mikrozentrifuga-hodi batera eta gero nahastu lisi-bufferarekin.Buffer hau oso desnaturalizatuta dago eta normalean fenol eta guanidina isotiozianatoz osatuta dago.Horrez gain, RNasaren inhibitzaileak normalean lisi-bufferean egon ohi dira RNA birus osorik isolatzea bermatzeko.

Lisi buffera gehitu ondoren, nahasketa-hodia pultsuz biribilizatu eta giro-tenperaturan inkubatu.Ondoren, birusa lisiaren bufferak eskaintzen dituen baldintza oso desnaturalizatzaileetan lisatzen da.

Lagina lisatu ondoren, zentrifugatzaile-hodi bat erabiltzen da arazketa prozedurarako.Lagina zentrifugatzailean kargatzen da eta gero zentrifugatzen da.

Prozedura hau fase solidoaren erauzketa-metodo bat da, non fase geldikoa silize gel matrize batez osatuta dagoena.

Gatz eta pH baldintza optimoetan, RNA molekulak silize mintzarekin lotzen dira.

Aldi berean, proteinak eta beste kutsatzaile batzuk kentzen dira.

Zentrifugazioaren ondoren, jarri zentrifugatzailearen hodia bilketa-hodi garbi batean, bota iragazkia eta, ondoren, gehitu garbiketa-buffer.

Jarri hodia zentrifugatzailean berriro garbiketa-buffera mintzean zehar behartzeko.Honek mintzetik geratzen diren ezpurutasun guztiak kenduko ditu, silize gelari lotuta dagoen RNA bakarrik utziz.

Lagina garbitu ondoren, jarri hodia mikrozentrifuga-hodi garbi batean eta gehitu eluzio-buffer.

Ondoren, zentrifugatzen da eluzio-buffera mintzean zehar behartzeko.Eluzio-buffer-ak RNA birikoa kentzen du spin-zutabetik eta proteina, inhibitzaile eta bestelako kutsatzailerik gabeko RNA araztua lortzen du.

2. URRATSA

Kontzentratu mistoa

RNA birikoa atera ondoren, hurrengo urratsa PCR anplifikaziorako erreakzio-nahasketa prestatzea da.Urrats honetan, kontzentratua erabiltzen da.Disoluzio kontzentratu hau aurrenahasketa bat, alderantzizko transkriptasa, nukleotidoak, abiarazte aurreratua, alderantzizko abiarazlea, TaqMan zunda eta DNA polimerasaz osatutako disoluzio kontzentratua da.

Azkenik, erreakzio-nahaste hori osatzeko, RNA txantiloia gehitzen da.Hodiak pultsu zurrunbiloaren bidez nahasten dira eta, ondoren, erreakzio-nahasketa PCR plakan kargatzen da.PCR plakak normalean 96 putzu ditu eta aldi berean hainbat lagin azter ditzake.

3. URRATSA

PCR anplifikazioa

Ondoren, jarri plaka PCR makinan, funtsean termoziklatu bat dena.

Denbora errealeko RT-PCR 2019ko koronavirus berria detektatzeko erabiltzen da RdrRP genean, E genean eta N genean xede-sekuentzia handituz.Xede-genearen aukeraketa abiaraztearen eta zundaren sekuentziaren araberakoa da.

RT-PCRren lehen urratsa alderantzizko transkripzioa da.ADN osagarriaren lehen katea sintetizatzen da, PCR alderantzizko lehengaiak abiarazten duena, ARN birikoaren genomaren zati osagarriarekin lotzen dena.Ondoren, alderantzizko transkriptasak DNA-nukleotidoak gehitzen ditu primer-aren 3' muturrean, RNA birikoaren osagarri den DNA sintetizatzeko.Urrats honen tenperatura eta iraupena erabiltzen diren abiarazleen, xede-RNAren eta alderantzizko transkriptasaren araberakoak dira.

Jarraian, hasierako desnaturalizazio-pauso bat aplikatzen da, ARN-DNA hibridoaren desnaturalizazioa eragiten duena.Urrats hau beharrezkoa da DNA polimerasa aktibatzeko.Aldi berean, alderantzizko transkriptasa desaktibatu egiten da.

PCR ziklo termiko multzo batez osatuta dago.Ziklo bakoitzak desnaturalizazio, annealing eta luzapen urratsez osatuta dago.

Desnaturalizazio-urratsak erreakzio-ganbera 95 gradu Celsius-ra berotzea eta hari bikoitzeko DNA txantiloia desnaturalizatzeko erabiltzea da.

Hurrengo urratsean, erreakzio-tenperatura 58 gradu Celsius-ra murrizten da, aurrekariak bere DNA kate bakarreko txantiloiaren zati osagarrira errezitatzeko aukera emanez.Errekuzimendu-tenperatura inprimagailuaren luzeraren eta konposizioaren araberakoa da zuzenean.

Luzapen urratsean, DNA polimerasak DNA txantiloiaren osagarria den DNA kate berri bat sintetizatzen du.Txantiloiari osagarrizko nukleo askeak gehituz, erreakzio-nahastetik 5′-tik 3′-ra arteko norabidean.Urrats honen tenperatura erabiltzen den DNA polimerasaren araberakoa da.

Lehenengo zikloaren ondoren, kate bikoitzeko DNA diana lortzen da.

Ondoren, sartu bigarren zikloan.Kate bikoitzeko DNA desnaturalizatu egiten da kate bakarreko bi DNA molekula sortzeko.

Hurrengo urratsean, erreakzio-tenperatura jaisten da, abiarazleak kate bakarreko DNA txantiloi bakoitzari erantzi egiten zaizkio eta Taq-man zunda xede-DNAren zati osagarriari errekodatzen zaio.

TaqMan zunda oligonukleotidoaren zundaren 5' muturrera kobalentez lotuta dagoen fluoroforo batez osatuta dago.Ziklogailuaren argi iturriak kitzikatzen duenean, fluoroforoak fluoreszentzia igortzen du.Horrez gain, zunda itzalgailu batek osatzen du 3′muturrean.Gene berriemailea itzalgailutik gertu egoteak fluoreszentzia detektatzea eragozten du.

Luzapen urratsean, DNA polimerasak kate berri bat sintetizatzen du.Polimerasa TaqMan zunda iristen denean, bere 5′nukleasaren jarduera endogenoak zunda mozten du, koloratzailea itzalgailutik bereiziz.

PCR-aren ziklo bakoitzean, koloratzaile-molekula gehiago askatzen dira, eta ondorioz, fluoreszentzia-intentsitateak sintetizatutako anplikoien kopuruaren proportzioan handitzen dira.

Metodo honek laginean dagoen sekuentzia jakin baten kopurua estimatzeko aukera ematen du.Ziklo bakoitzean kate bikoitzeko DNA zatien kopurua bikoiztu egiten da.Beraz, PCR oso lagin txikiak aztertzeko erabil daiteke.

Seinale fluoreszentea, wolframio-lanpara halogenoa, kitzikapen-iragazkia, islatzailea, lentea, igorpen-iragazkia eta karga-akoplatutako gailu-erabili CCD kamera neurtzeko.

4. URRATSA Detektatu

Seinale fluoreszentea, wolframio-lanpara halogenoa, kitzikapen-iragazkia, islatzailea, lentea, igorpen-iragazkia eta karga-akoplatutako gailu-erabili CCD kamera neurtzeko.

Lanparatik iragazitako argia islatzaileak islatzen du, kondentsadorearen lentetik igarotzen da eta zulo bakoitzaren erdigunera bideratzen da.Ondoren, zulotik igortzen den fluoreszentzia ispilutik islatzen da, igorpen-iragazkitik igarotzen da eta CCD kamerak detektatzen du.PCR ziklo bakoitzean, autokitzitatutako fluoroforo-argia detektatu daiteke CCD-k.

Hartutako argia datu digital bihurtzen du.Metodo honi denbora errealeko PCR deitzen zaio eta PCR erreakzioaren aurrerapena denbora errealean kontrolatzeko aukera ematen du.