Ikuspegi orokorra
Landare transgenikoen identifikazio azkarra
Testua/Tong Yucheng
Operazio esperimentala/Han Ying
Editorea/Wen Youjun
Hitzak/1600+
Iradokitako irakurketa denbora/8-10 minutu
Landare transgenikoen identifikazio azkarra
Laborategian etorri berria den heinean, ez da lan ona bihurtze-tasa baxua duten landare-sorta batetik landare positiboak kentzea.Lehenik eta behin, DNA lagin kopuru handitik banan-banan atera behar da, eta gero gene arrotzak detektatuko dira PCR bidez.Hala ere, emaitzak sarritan hutsuneak eta elementu batzuk dituzten bandak izaten dira noizean behin, baina ezinezkoa da detekzio galduak edo detekzio faltsuak dauden zehaztea..Oso indargabea al da horrelako prozesu eta emaitze esperimentalari aurre egitea?Ez kezkatu, anaiak landare positibo transgenikoak erraz eta zehaztasunez ezabatzen irakasten dizu.
1. urratsa: Diseinua detektatzeko abiarazleak
Zehaztu probatu beharreko laginaren arabera detektatu beharreko gene endogenoa eta gene exogenoa, eta hautatu genearen 100-500bp sekuentzia adierazgarri bat primer diseinurako.Primer onek detekzio-emaitzen zehaztasuna berma dezakete eta detekzio-denbora laburtu dezakete (ikusi eranskina erabili ohi diren detekzio-hastapenetarako).
Ohar:
Diseinatu berri diren abiarazleek erreakzio-baldintzak optimizatu eta detekzioaren zehaztasuna, zehaztasuna eta detekzio-muga egiaztatu behar dituzte eskala handiko detekzioa egin aurretik.
2. urratsa:Protokolo esperimentala garatzea
Kontrol positiboa: erabili xede-zatiak duen DNA araztua txantiloi gisa, PCR erreakzio-sistema eta baldintzak normalak diren zehazteko.
Kontrol negatiboa/hutsean: Erabili DNA txantiloia edo ddH2O xede-zatirik ez duena txantiloi gisa PCR sisteman kutsadura-iturririk dagoen detektatzeko.
Barne-erreferentzia-kontrola: erabili probatu nahi den laginaren gene endogenoaren lehen/zunda konbinazioa txantiloia PCR bidez detektatu daitekeen ebaluatzeko.
Ohar:
Proba bakoitzerako kontrol positiboak, negatiboak/hutsak eta barne-kontrolak ezarri behar dira, emaitza esperimentalen baliozkotasuna ebaluatzeko.
3. urratsa: Esperimentuen prestaketa
Erabili aurretik, begiratu disoluzioa uniformeki nahasten den.Prezipitazioa aurkitzen bada, erabili aurretik argibideen arabera disolbatu eta nahastu behar da.2×PCR nahasketa pipetatu eta mikropipetarekin behin eta berriz nahastu behar da erabili aurretik, ioien banaketa irregularra ekiditeko.
Ohar:
Atera argibideak eta irakurri arretaz, eta egin esperimentu aurretik prestaketak argibideei jarraikiz.
4. urratsa: Prestatu PCR erreakzio-sistema
Protokolo esperimentalaren arabera, nahastu lehengaiak, H2O, 2×PCR nahastu, zentrifugatu eta banatu erreakzio-hodi bakoitzean.
Ohar:
Eskala handiko edo epe luzerako probak egiteko, UNG entzima duen PCR erreakzio sistema bat erabiltzea gomendatzen da, PCR produktuek eragindako aerosol kutsadura eraginkortasunez ekidin dezakeena.
5. urratsa: Gehitu erreakzio txantiloia
Direct PCR teknologia erabiliz, ez dago azido nukleikoen arazketa prozesu aspergarririk behar.Lagin txantiloia 10 minutuko epean prestatu daiteke eta dagokion PCR erreakzio sistemara gehitu.
Ohar:
Lysis metodoak detekzio efektu hobea du, eta lortutako produktua detekzio erreakzio anitzetarako erabil daiteke.
5.1: Hostoen PCR zuzena
Eskuliburuko irudiaren tamainaren arabera, moztu hosto-ehuna 2-3 mm-ko diametroarekin eta jarri PCR erreakzio sisteman.
Oharra: Ziurtatu hosto-zatiak PCR erreakzio-soluzioan guztiz murgilduta daudela eta ez gehitu hosto-ehun gehiegirik.
5.2: Hostoen lisi metodoa
Moztu hosto-ehuna 5-7 mm-ko diametroarekin eta jarri zentrifugatzaile-hodi batean.Hosto helduak aukeratzen badituzu, saihestu hostoaren zain nagusiko ehunak erabiltzea.Pipeta ezazu 50ul Buffer P1 lisatu zentrifuga-hodi batean, lisadoak hosto-ehuna guztiz murgil dezakeela ziurtatzeko, jarri termoziklatu batean edo metalezko bainu batean eta lisatu 95 °C-tan 5-10 minutuz.
Gehitu 50ul Buffer P2 neutralizazio disoluzioa eta ondo nahastu.Lortutako lisatua txantiloi gisa erabil daiteke eta PCR erreakzio sistemara gehitu.
Oharra: txantiloiaren kopurua PCR sistemaren % 5-10 artean egon behar du, eta ez du % 20tik gorakoa izan behar (adibidez, 20μl PCR sistema batean, gehitu 1-2μl lisi buffer, 4μl baino gehiago).
6. urratsa: PCR erreakzioa
PCR erreakzio-hodia zentrifugatu ondoren, jarri PCR tresna batean anplifikatzeko.
Ohar:
Erreakzioak araztutako txantiloia erabiltzen du anplifikaziorako, beraz, anplifikazio-zikloen kopurua 5-10 ziklo gehiago da araztutako DNA txantiloia erabiltzean baino.
7. urratsa: Elektroforesiaren detekzioa eta emaitzen analisia
M: 100bp DNA Eskailera
1\4: ADN araztuaren metodoa
2\5: Zuzeneko PCR metodoa
3\6: Kontrol hutsa
Kalitate kontrola:
Esperimentuan ezarritako kontrol ezberdinen proben emaitzek baldintza hauek bete behar dituzte.Bestela, arazoaren kausa aztertu behar da, eta proba berriro egin behar da arazoa kendu ondoren.
1. taula. Hainbat kontrol-talderen probaren emaitza normalak
*Plasmidoa kontrol positibo gisa erabiltzen denean, gene endogenoaren probaren emaitza negatiboa izan daiteke
Emaitza epaia:
A. Laginaren gene endogenoaren probaren emaitza negatiboa da, eta adierazten du PCR arrunta detektatzeko egokia den DNA ezin dela lagintik atera edo ateratako DNAk PCR erreakzio inhibitzaileak dituela eta DNA berriro atera behar dela.
B. Laginaren gene endogenoaren probaren emaitza positiboa da, eta gene exogenoaren probaren emaitza negatiboa da, PCR arrunta detektatzeko egokia den DNA lagintik ateratzen dela adieraziz, eta laginean XXX genea ez dela hautematen baloratu daiteke.
C. Laginaren gene endogenoaren probaren emaitza positiboa da, eta gene exogenoaren probaren emaitza positiboa da, PCR arrunta detektatzeko egokia den DNA lagintik atera dela eta laginaren DNAk XXX genea duela adierazten du.Berrespen-esperimentuak gehiago egin daitezke.
8. urratsa: detekzio-hautsak diseinatzea
Esperimentuaren ondoren, erabili % 2 sodio hipoklorito disoluzioa eta % 70 etanol disoluzioa esperimentu-eremua garbitzeko, ingurumenaren kutsadura saihesteko.
eranskina
2. Taula. Genetikoki eraldatutako landareen PCR orokorrean detektatzeko erabili ohi diren abiarazleak
Erreferentzia dokumentua:
SN/T 1202-2010, Elikagaietan genetikoki eraldatutako landare-osagaien PCR detektatzeko metodo kualitatiboa.
Nekazaritza Ministerioaren 2010-5-1485 Iragarkia, Genetikoki eraldatutako landareen eta haien produktuen osagaien probak-arroza M12 eta bere deribatuak.
Argitalpenaren ordua: 2021-09-09
