• facebook
  • linkedin
  • youtube

Laborategian berria denez, ez da lan ona bihurtze-tasa baxua duten landare-sorta batetik landare positiboak kentzea.Lehenik eta behin, DNA lagin kopuru handitik banan-banan atera behar da, eta gero gene arrotzak detektatuko dira PCR bidez.Hala ere, emaitzak sarritan hutsuneak eta elementu batzuk dituzten bandak izaten dira noizean behin, baina ezinezkoa da detekzio galduak edo detekzio faltsuak dauden zehaztea..Oso indargabea al da horrelako prozesu eta emaitze esperimentalari aurre egitea?Ez kezkatu, anaiak landare positibo transgenikoak erraz eta zehaztasunez ezabatzen irakasten dizu.

1. urratsa

Diseinua detektatzeko abiarazleak

Azkar1

Zehaztu probatu beharreko laginaren arabera detektatu beharreko gene endogenoa eta gene exogenoa, eta hautatu genearen 100-500bp sekuentzia adierazgarri bat primer diseinurako.Primer onek detekzio-emaitzen zehaztasuna berma dezakete eta detekzio-denbora laburtu dezakete (ikusi eranskina erabili ohi diren detekzio-hastapenetarako).

Oharra: Diseinatu berri diren abiarazleek erreakzio-baldintzak optimizatu behar dituzte eta eskala handiko detekzioaren aurretik detekzioaren zehaztasuna, zehaztasuna eta detekzio-muga egiaztatu behar dituzte.

2. urratsa

Protokolo esperimentala diseinatzea

Azkar2

Kontrol positiboa: erabili xede-zatiak duen DNA araztua txantiloi gisa, PCR erreakzio-sistema eta baldintzak normalak diren zehazteko.

Kontrol negatiboa/hutsean: Erabili xede-zatirik ez duen DNA txantiloia edo ddH2O txantiloi gisa PCR sisteman kutsadura-iturririk dagoen detektatzeko.

Barne-erreferentzia-kontrola: erabili probatu nahi den laginaren gene endogenoaren lehen/zunda konbinazioa txantiloia PCR bidez detektatu daitekeen ebaluatzeko.

Oharra:

Proba bakoitzerako kontrol positiboak, negatiboak/hutsak eta barne-kontrolak ezarri behar dira, emaitza esperimentalen baliozkotasuna ebaluatzeko.

Esperimentuen prestaketa

Azkar3

Erabili aurretik, begiratu disoluzioa uniformeki nahasten den.Prezipitazioa aurkitzen bada, erabili aurretik argibideen arabera disolbatu eta nahastu behar da.2×PCR nahasketa pipetatu eta mikropipetarekin behin eta berriz nahastu behar da erabili aurretik, ioien banaketa irregularra ekiditeko.

Oharra:

Atera eskuliburua eta irakurri arretaz, eta egin esperimentuaren aurretik prestaketak eskuliburuaren eskakizunekin bat etorriz.

4. urratsa

Prestatu PCR erreakzio-sistema

Azkar4

Protokolo esperimentalaren arabera, lehengaiak, H2O eta 2×PCR nahasketa uniformeki nahastu, zentrifugatu eta banatu erreakzio-hodi bakoitzean.

Oharra:

Eskala handiko edo epe luzerako probak egiteko, UNG entzima duen PCR erreakzio sistema bat erabiltzea gomendatzen da, PCR produktuek eragindako aerosol kutsadura eraginkortasunez ekidin dezakeena.

5. urratsa

Gehitu erreakzio txantiloia

Azkar5

Direct PCR teknologia erabiliz, ez dago azido nukleikoen arazketa prozesu neketsurik behar, lagin txantiloia 10 minututan prestatu daiteke eta dagokion PCR erreakzio sistema gehi daiteke.

Oharra:

Zatiketa metodoak detekzio efektu hobea du, eta lortutako produktua detekzio erreakzio anitzetarako erabil daiteke.

Azkar6

5.1: Hostoen hedapen zuzena

Eskuliburuko irudiaren tamainaren arabera, moztu hosto-ehuna 2-3 mm-ko diametroarekin eta jarri PCR erreakzio sisteman.

Oharra: Ziurtatu hosto-zatiak PCR erreakzio-soluzioan guztiz murgilduta daudela eta ez gehitu hosto-ehun gehiegirik.

5.2: Hosto zatiketaren metodoa

Moztu hosto-ehuna 5-7 mm-ko diametroarekin eta jarri zentrifugatzaile-hodi batean.Hosto helduak aukeratzen badituzu, saihestu hostoaren zain nagusiko ehunak erabiltzea.Pipeta ezazu 50ul Buffer P1 lisatu zentrifuga-hodi batean, lisadoak hosto-ehuna guztiz murgil dezakeela ziurtatzeko, jarri termoziklatu batean edo metalezko bainu batean eta lisatu 95 °C-tan 5-10 minutuz.

Azkar7

Gehitu 50ul Buffer P2 neutralizazio disoluzioa eta ondo nahastu.Lortutako lisatua txantiloi gisa erabil daiteke eta PCR erreakzio sistemara gehitu.

Oharra: txantiloiaren kopurua PCR sistemaren % 5-10 artean dago, eta ez du % 20tik gorakoa izan behar (adibidez, 20μl PCR sistema batean, gehitu 1-2μl lisi-soluzio, 4μl baino gehiago).

6. urratsa

PCR erreakzioa

Azkar8

PCR erreakzio-hodia zentrifugatu ondoren, PCR tresna batean jartzen da anplifikaziorako.

Oharra:

Erreakzioak araztutako txantiloia erabiltzen du anplifikaziorako, beraz, anplifikazio-zikloen kopurua 5-10 ziklo gehiago da araztutako DNA txantiloia erabiltzean baino.

7. urratsa

Elektroforesiaren detekzioa eta emaitzen analisia

Azkar9

M: 100bp DNA eskailera

1\4: ADN araztuaren metodoa

2\5: Zuzeneko PCR metodoa

3\6: Kontrol hutsa

QC:

Esperimentuan ezarritako kontrol ezberdinen proben emaitzek baldintza hauek bete behar dituzte.Bestela, arazoaren kausa aztertu behar da, eta proba berriro egin behar da arazoa kendu ondoren.

1. taula. Hainbat kontrol-talderen probaren emaitza normalak

*Plasmidoa kontrol positibo gisa erabiltzen denean, gene endogenoaren probaren emaitza negatiboa izan daiteke

Emaitza epaia:

A. Laginaren gene endogenoaren probaren emaitza negatiboa da, eta adierazten du PCR arrunta detektatzeko egokia den DNA ezin dela lagintik atera edo ateratako DNAk PCR erreakzio inhibitzaileak dituela eta DNA berriro atera behar dela.

B. Laginaren gene endogenoaren probaren emaitza positiboa da, eta gene exogenoaren probaren emaitza negatiboa da, PCR arrunta detektatzeko DNA egokia den lagintik ateratzen dela adieraziz, eta XXX genea laginean detektatzen ez dela epai daiteke.

C. Laginaren gene endogenoaren probaren emaitza positiboa da eta gene exogenoaren probaren emaitza positiboa da, lagintik PCR arrunta detektatzeko egokia den DNA atera dela eta laginaren DNAk XXX genea duela adierazten du.Berrespen-esperimentuak gehiago egin daitezke.

8. urratsa

Diseinua detektatzeko abiarazleak

Azkar10

Esperimentuaren ondoren, erabili 2% sodio hipoklorito-soluzioa eta 70% etanol-soluzioa esperimentu-eremua garbitzeko, ingurumenaren kutsadura saihesteko.


Argitalpenaren ordua: 2021-08-08