Alderantzizko transkriptasa tradizionalek ezin dituzte tenperatura altuak jasan (MMLVren jarduerarako tenperatura optimoa 37-50 °C da, eta AMV 42-60 °C).RNA birikoa konplexuagoa ezin da modu eraginkorrean atzera transkribatu cDNA-ra tenperatura baxuetan, eta ondorioz, detekzio eraginkortasuna murriztea.RT-qPCR tradizionalak, oro har, funtsezko bi entzimaren parte hartzea eskatzen du (alderantzizko transkriptasa eta DNA polimerasa), eta horrek ezinezkoa egiten du erreakzio-sistemaren funtzionamendua erraztea eta kostua murriztea.Hemen tenperatura altuko bi alderantzizko transkriptasa aurkeztuko ditugu, TtH eta RevTaq.Bi entzima hauek DNA polimerasaren funtzioa ere badute, beraz, entzima bifuntzionalak deitzen zaie.

TtH DNA polimerasa

TtH-ri buruz entzun behar duzu, Thermus thermophilus HB8 bakterio termofilotik eratorritakoa.Mg2+ bezalako katioi dibalenteen aurrean, DNA polimerasaren jarduera du.Asko erabiltzen da Taq entzima bezalako PCR erreakzioetan, baina Taq entzimak baino bero-erresistentzia handiagoa du, beraz, PCRn ere eragin hobea du GC eduki handiko txantiloiekin.

· Entzima honek, funtsean, ez du 3′→5′ exonukleasa jarduerarik eta 5′→3′ exonukleasa jarduerarik, beraz, didesoxi sekuentziaziorako ere erabil daiteke.

· Entzima honek RTasaren jarduera du.Mn2+-ren aurrean, RTasaren jarduera hobetuko da.Ezaugarri hau erabiliz, alderantzizko transkripzio erreakzioa eta PCR erreakzioa hodi berean egiteko erabil daiteke, hau da, urrats bakarreko RT-PCR.Hala ere, Mn2+-ren presentzian, RT-PCRren zehaztasuna ez da handia.RT jarduerak ez du zerikusirik rnaasa H jarduerarekin.

· Tth-DNA polimerasaren jarduera areagotzeak (pH9, optimoa +55℃～+70℃, gehienez +95℃) RNA egitura sekundarioak eragindako arazoak gainditzen ditu.Lortutako cDNA PCR bidez anplifikatu daiteke entzima berarekin, Mg2+ ioien presentzian.

· Tth-DNA polimerasak alderantzizko transkripzioa eta DNA anplifikazioa tenperatura altuetan egiteko duen gaitasunari esker, entzima hau baliagarria da ARN zelular eta birikoaren RT-PCR kuantitatiborako, klonaziorako eta gene-espresioa egiteko.
· Tth-DNA polimerasa RT-PCRrako erabiltzen da RNA 1kb-raino anplifikatzeko.

Ezaugarriak eta abantailak

T. DNA polimerasa:

• Ziurtatu polimerasaren kate-erreakzio optimizatua (PCR) produktuaren tamaina, gutxienez 1000 bp RT-PCR erreakzioan

• Onartu desoxirribonukleosido trifosfato eraldatua substratu gisa

• Ez dago erlazionatuta RNasa H jarduerarekin

• Egonkortasun termiko handia du arazoak gainditzeko, normalean RNAn dagoen egitura sekundario altuarekin lotuta

RevTaq RT-PCR DNA polimerasa

Beroarekiko erresistentea den DNA polimerasa, alderantzizko transkriptasa jarduera duena

RevTaq-RT-PCR-DNA polimerasa ingeniaritza, bero-erresistentzia handiko, funtzio bikoitzeko entzima bat da, eboluzio zuzendu eta artifizialaren bidez lortutako alderantzizko transkriptasa eta DNA polimerasa jarduerak dituena.

· RevTaq RT-PCR DNA polimerasaren erdi-bizitza 95 °C-tan 40 minutu baino handiagoa da.

· RevTaq RT-PCR DNA polimerasak tenperatura altuko alderantzizko transkripzioa ahalbidetzen du RNA txantiloitik zuzenean, eta alderantzizko transkripzioaren urratsa hainbat aldiz errepika daiteke cDNA txantiloi gehiago sortzeko.

· RevTaq RT-PCR DNA polimerasak RT-PCR “zero-pausoa” ahalbidetzen du (ez dago alderantzizko transkripzio-pauso isotermikorik), PCR ziklikoaren luzapen-pausoan alderantzizko transkripzioa eta DNA-anplifikazioa aldi berean gertatzen direlako.Honek, gainera, alderantzizko transkripzio erreakzioa sustatzen du tenperatura altuetan, eta, ondorioz, tenperatura altuetan RNAren egitura sekundario sendoa urtzean sortzen diren arazoak minimizatzen dira.

· Aptameroetan oinarritutako abiarazte beroaren formula dela eta, RevTaq RT-PCR DNA polimerasak emaitza hobeak emango ditu erretiro- eta hedapen-tenperatura 57 °C baino handiagoa denean.

· Entzima beroarekiko erresistentea denez, oso urtze-puntu altuak (>60°C) dituzten abiarazleak eta zundak diseinatzea gomendatzen da.

· Erreakzioa konfiguratzeko prozesuan tenperatura-gradiente baten bidez erreakzioa/hedatze-pausoaren tenperatura optimizatzea gomendatzen da.

· Zenbat eta tenperatura handiagoa izan, orduan eta espezifikotasun handiagoa izango du PCRren.Alderantzizko transkripzio-zikloa PCR zikloa baino tenperatura altuagoan egiten da normalean, DNA Primer:RNA Template hibridazioak normalean DNA Primer:cDNA Template duplex baino urtze-puntu handiagoa duelako.

· RevTaq RT-PCR DNA polimerasa genetikoki diseinatu eta optimizatuta dago, eta anplikonaren tamaina 60-300 bp bitartekoa da.

RevTaq RT-PCR DNA polimerasa detektatzeko muga 4 kopiara iristen da

Erreakzio-sistema optimizatua (urtze-puntu handiko lehengaiak ezartzea) irudian ageri da.RevTaq RT-PCR DNA polimerasak bultzatutako RT-PCR-k TaqPath 1 urratseko RT-qPCR nahasketa maisua baino sentikortasun hobea erakusten du, eta detekzio txikiagoa Laginaren diluzio-gradientea.

Abantaila gehiago:

Hasierako funtzioa → Hasierako desnaturalizazio termikoaren urratsa salta daiteke.

Hot-start aptamer formula → Eman entzimaren %100eko jarduera berehala eta saihestu tenperatura baxuetan (<57°C) anplifikazio ez-espezifikoa.

Zatiketa-funtzioa → RNA erauzteko urratsa baztertzen da, RevTaq RT-PCR DNA polimerasak erreakzio-lagin gordinak ere prozesatu ditzakeelako.Berehala suntsitu ditzake eukariotoen, bakterioen eta birusen zelula-mintzak RT-PCR ziklo bero batean.

IVD lehengaien maila → kalitate estandar altuak eta prezio oso lehiakorrak