PCR da gehien erabiltzen den azido nukleikoen anplifikazio teknologia eta oso erabilia da bere sentsibilitateagatik eta espezifikotasunagatik.Hala ere, PCR-k desnaturalizazio termiko errepikatua behar du eta ezin ditu tresna eta ekipoetan konfiantzak dituen mugak kendu, eta horrek bere aplikazioa mugatzen du eremu klinikoko probetan.

1990eko hamarkadaren hasieratik, desnaturalizazio termikorik behar ez duen tenperatura konstantea anplifikatzeko teknologia garatzen hasi dira laborategi asko.Orain begizta bidezko anplifikazio isotermiko teknologia, harien ordezko anplifikazio isotermiko teknologia, rolling circle isotermiko anplifikazio teknologia eta azido nukleikoen sekuentziaren mendekotasuna garatu dute.Anplifikazio isotermikoko teknologia eta beste teknologia batzuk. 

Loop bidezko anplifikazio isotermikoa

Anplifikazio-printzipioa DNA oreka dinamikoan dagoela 65 °C ingurukoa da.Edozein abiarazle base-parekatuta dagoenean eta kate bikoitzeko DNAren zati osagarrira hedatzen denean, beste katea disoziatuko da eta kate bakarrera bihurtuko da.

Tenperatura horretan, DNAk 4 abiarazle espezifiko erabiltzen ditu kate-desplazamenduko DNA polimerasa batean oinarritzeko, kate-desplazamenduko DNAren sintesia etengabe autozirkulatzeko.

Lehenik eta behin, zehaztu xede-genean F3, F2, F1, B1, B2, B3 6 eskualde espezifikoak, eta, ondoren, 6 eskualde espezifiko hauetan oinarrituta 4 abiarazte diseinatu (beheko irudian erakusten den moduan):

Aurrerako barruko primer (FIP) F1c eta F2z osatuta dago.

Atzerako barruko primera (BIP) B1c eta B2z osatuta dago, eta TTTT tartekatzaile gisa erabiltzen da erdian.

Kanpoko F3 eta B3 abiarazleak, hurrenez hurren, helburu genearen F3 eta B3 eskualdez osatuta daude.

LAMP erreakzio-sisteman, barruko primeraren kontzentrazioa kanpoko lehenarena baino hainbat aldiz handiagoa da.Barneko abiarazlea txantiloi-katearekin konbinatzen da lehenengo kate osagarri bat sintetizatzeko, DNA kate bikoitza osatzeko.Ondoren, kanpoko primera txantiloiaren katearekin konbinatzen da DNA kate bikoitza osatzeko.BstDNA polimerasaren eraginez, barruko primerak sintetizatutako kate osagarria askatzen da.Erreakzio batzuen ondoren, kate osagarriak, azkenean, DNA kate bakarra osatzen du dumbbell egitura duena.

Dumbbell-egiturako DNA kate bakarrekoa txantiloi gisa erabiltzen da etengabe mutur irekia duen trantsizio-begizta-egiturako DNA bat osatzeko.Barneko eta kanpoko abiarazleek trantsiziozko zurtoin-begizta-egituraren DNA gidatzen dute harien desplazamendu eta hedapen-erreakzioak etengabe jasateko, eta, azkenik, luzera desberdineko zurtoin-begizta-egitura anitz eratzeko.DNA nahastea.

Begizta bidezko anplifikazio isotermikoaren abantailak eta desabantailak

LAMParen abantailak:

(1) Anplifikazio-eraginkortasun handia, xede-genearen 1-10 kopia eraginkortasunez anplifikatu ditzakeena ordubeteko epean, eta anplifikazio-eraginkortasuna PCR arruntarena baino 10-100 aldiz handiagoa da.

(2) Erreakzio denbora laburra da, espezifikotasuna indartsua da eta ez da ekipamendu berezirik behar.

LAMP-en gabeziak:

(1) Primeren eskakizunak bereziki handiak dira.

(2) Anplifikatutako produktua ezin da klonatzeko eta sekuentziatzeko erabili, baina epaitzeko soilik erabil daiteke.

(3) Bere sentikortasun handia dela eta, erraza da aerosolak sortzea, positibo faltsuak eraginez eta proben emaitzei eraginez.

Strand desplazamendu anplifikazioa

Strand desplacement amplification (SDA) in vitro DNA isotermiko anplifikazio teknika bat da, Walker estatubatuar ikerlariak 1992an proposatutako erreakzio entzimatikoan oinarrituta.

SDAren oinarrizko sistemak murrizketa endonukleasa bat, kateen desplazamendu jarduera duen DNA polimerasa, bi abiarazle pare, dNTP eta kaltzio eta magnesio ioiak eta buffer sistemak barne hartzen ditu.

Kateen desplazamenduaren anplifikazioaren printzipioa xede-ADNaren bi muturretako endonukleasaren errekonozimendu-sekuentzia kimikoki eraldatuan oinarritzen da.Endonukleasak DNA katearen hutsunea irekitzen du bere ezagutze gunean, eta DNA polimerasak 3′ Muturra zabaltzen du eta hurrengo DNA katea ordezkatzen du.

Ordeztutako DNAren kate bakarrak abiarazleekin konbinatu eta DNA polimerasaren bidez kate bikoitzetara heda daitezke.Prozesu hau etengabe errepikatzen da, xede-sekuentzia modu eraginkorrean anplifikatu dadin.

Hari-desplazamenduaren anplifikazio-teknologiaren abantailak eta desabantailak

SDAren abantailak:

Anplifikazio-eraginkortasuna handia da, erreakzio denbora laburra da, espezifikotasuna indartsua da eta ez da ekipamendu berezirik behar.

SDAren gabeziak:

Produktuak ez dira uniformeak, eta kate bakarreko eta bikoitzeko produktu batzuk beti SDA zikloan ekoizten dira, eta isatsa ezinbestean gertatuko da elektroforesiaren bidez detektatzean.

Rolling zirkuluaren anplifikazioa

Rolling circle anplifikazioa (RCA) organismo patogenoetatik DNA kopiatzeko metodoa erabiliz proposatzen da biribilketa zirkuluaren bidez.Tenperatura konstantean txantiloi gisa kate bakarreko DNA zirkularra eta DNA polimerasa berezi bat (adibidez, Phi29) erabiltzeari egiten dio erreferentzia. Zirkulu biribileko DNA sintesiaren eraginpean, xede genearen anplifikazioa lortzeko.

RCA anplifikazio linealean eta anplifikazio esponentzialean bana daiteke.RCA linealaren eraginkortasuna 10era irits daiteke⁵aldiz, eta RCA esponentzialaren eraginkortasuna 10era irits daiteke⁹aldiz.

Bereizketa sinplea, beheko irudian ikusten den bezala, a anplifikazio linealak abiarazle 1 bakarrik erabiltzen du, b anplifikazio esponentzialak 2 abiarazle ditu.

RCA lineala primer RCA bakarra ere deitzen zaio.Primer bat DNA zirkularra lotzen da eta DNA polimerasaren eraginez hedatzen da.Produktua hari bakar lineal bat da, begizta bakar baten luzera baino milaka aldiz errepikatzen diren sekuentzia kopuru handia duena.

RCA linealaren produktua hasierako abiarazleari beti konektatuta dagoenez, seinalearen finkapen erraza abantaila handia da.

RCA esponentziala, Hyper adarkaturiko anplifikazio HRCA (Hyper adarkatua RCA) izenez ere ezagutzen dena, RCA esponentzialean, primer batek RCA produktua anplifikatzen du, bigarren primerak RCA produktuarekin hibridatzen du eta hedatzen da, eta ordezkoa dagoeneko RCA produktuari lotuta dago.

Rolling circle azido nukleikoaren anplifikazioaren abantailak eta desabantailak

RCAren abantailak:

Sentikortasun handia, espezifikotasun ona eta funtzionamendu erraza.

RCAren gabeziak:

Atzeko planoko arazoak seinalea hautemateko garaian.RCA erreakzioan zehar, zirkulatu gabeko giltzarrapo-zundak eta lotu gabeko zundaren DNA txantiloiak edo RNAk hondoko seinale batzuk sor ditzakete. 

Nucleicacid sekuentzian oinarritutako anplifikazioa

Azido nukleikoen sekuentzian oinarritutako anplifikazioa (NASBA) PCR oinarri hartuta garatutako teknologia berri bat da.Azido nukleikoen anplifikazio jarraitu eta isotermiko bat da, T7 sustatzaile-sekuentzia duten abiarazle pare batek gidatuta.Teknologiak RNA txantiloia 109 aldiz handitu dezake 2 ordu ingurutan, hau da, PCR metodo konbentzionala baino 1000 aldiz handiagoa eta ez du ekipamendu berezirik behar.

Teknologia hau gaixotasunen diagnostiko azkarra egiteko erabili izan da agertu bezain laster, eta gaur egun enpresa askok erabiltzen dute metodo hori RNA detektatzeko kitetan.

RNA anplifikazioak alderantzizko transkripziorako PCR teknologia ere erabil dezakeen arren, NASBAk bere abantailak ditu: tenperatura nahiko konstanteetan egin daiteke, eta PCR teknologia tradizionala baino egonkorragoa eta zehatzagoa da.

Erreakzioa 41 gradu Celsius-etan dago eta AMV (hegazti mieloblastosi birusa) alderantzizko transkriptasa, RNasa H, T7 RNA polimerasa eta abiarazte pare bat behar ditu osatzeko.

Prozesuak batez ere barne hartzen ditu:

Aurrerako abiarazleak T7 sustatzailearen sekuentzia osagarria dauka.Erreakzioan zehar, lehen-lehentzailea RNA kateari lotzen zaio eta AMV entzimak katalizatzen du DNA-RNA kate bikoitza osatzeko.

RNasak H-k ARNa digeritzen du kate bikoitzeko hibridoan eta kate bakarreko DNA mantentzen du.

Alderantzizko primeraren eta AMV entzimaren eraginez, T7 sustatzaile-sekuentzia duen DNA kate bikoitza sortzen da.

T7 RNA polimerasaren eraginez, transkripzio-prozesua amaitzen da eta xede-RNA kopuru handia sortzen da.

NASBAren abantailak:

(1) Bere primerak T7 sekuentzia sustatzaile bat du, baina kate bikoitzeko DNA arrotzak ez du T7 sustatzaile sekuentziarik eta ezin da anplifikatu, beraz, teknologia honek espezifikotasun eta sentikortasun handia du.

(2) NASBAk zuzenean txertatzen du alderantzizko transkripzio prozesua anplifikazio erreakzioan, erreakzio denbora laburtuz.

NASBAren desabantailak:

(1) Erreakzio-osagaiak konplexuagoak dira.

(2) Hiru entzima mota behar dira erreakzioaren kostua handiagoa izan dadin.