PCR, anitz PCR, In situ PCR, Alderantzizko PCR, RT-PCR, qPCR (1)–PCR

Hainbat PCRren kontzeptuak, urratsak eta xehetasunak ordenatuko ditugu

Ⅰ. PCR

Polimerasaren kate-erreakzioa, PCR izenez ezagutzen dena, DNA zati zehatzak handitzeko erabiltzen den teknologia biologiko molekularra da.In vitro DNAren erreplikazio berezitzat har daiteke.DNA polimerasa (DNA Polimerasa I) 1955ean aurkitu zen eta Klenow E. Coli-ren zatia, balio esperimentala eta praktikotasuna duena, H. Klenow doktoreak aurkitu zuen 1970eko hamarkadaren hasieran, baina entzima honek tenperatura jasaten ez duenez, tenperatura altuak endekatu dezake, eta, beraz, ez du polimerasaren erreakzioa endekapena betetzen.Gaur egun erabiltzen diren entzimak (Taq polimerasa izenekoak), Thermus aquaticus-etik isolatu ziren 1976an. Bere ezaugarria tenperatura altuei aurre egin diezaiekeela eta entzima aproposa da, baina 1980ko hamarkadatik aurrera asko erabiltzen da.PCR-ren jatorrizko prototipo primitiboaren jatorrizko kontzeptua geneen konponketa eta kopiaren antzekoa da, KJell Kleppe doktoreak 1971n proposatu zuena. Lehenengo gene kopia sinplea eta epe laburrean argitaratu zuen (PCRren lehen bi zikloko erreakzioen antzekoa).Gaur garatutako PCR Kary B. Mullis doktoreak garatu zuen 1983an. Mullis doktoreak urte hartan PE enpresei zerbitzatzen zien, beraz, PEk estatus berezia du PCR industrian.Mullis doktoreak 1985ean argitaratu zuen ofizialki Saiki eta beste batzuekin erlazionatutako lehen artikulua. Harrezkero, PCRren erabilera egunean milaka kilometrokoa da, eta erlazionatutako paperen kalitateak beste ikerketa-metodo asko desegokitzen dituela esan daiteke.Ondoren, PCR teknologia oso erabilia da ikerketa zientifiko biologikoan eta aplikazio klinikoetan, biologia molekularreko ikerketaren teknologia garrantzitsuena bilakatuz.Mullisek 1993ko Kimikako Nobel Saria ere irabazi zuen.

PCRPrintzipioa

PCR teknologiaren oinarrizko printzipioa DNAren erreplikazio naturalaren antzekoa da, eta bere espezifikotasuna xede-sekuentziaren bi muturrekiko osagarria den oligonukleotido-hastapenaren araberakoa da.PCR endekapen-annealing-hedatze-oinarrizko hiru erreakzio urratsez osatuta dago: ①ADN txantiloiaren endekapena: DNA txantiloia 93 °C ingurura berotu ondoren denbora jakin batean, DNA txantiloiaren PCR anplifikazioak sortutako kate bikoitzeko DNAren soluzio bikoitzak ADN txantiloiaren anplifikazioaren ondorioz, kate bakar bat egin ezazu, hurrengo erreakzioarekin konbinatu ahal izateko.②ADN txantiloiaren eta abiarazlearen errekostea (konposatua): DNA txantiloia berotu eta kate bakarrean degeneratu ondoren, tenperatura 55 °C ingurura jaisten da.Primeraren eta DNA txantiloiaren kate bakarreko sekuentzia osagarria.③Primeraren luzapena: DNA txantiloia: TaqDNA polimerasaren ekintzan oinarritzen da, dNTP erreakzio lehengai gisa.Mantendu erreplikazioaren printzipioa, sintetiza ezazu txantiloiaren DNA katearen osagarri den kopia-kate erdi erreserbatua, eta errepikatu zikloaren endekapena-annealing-hedapena hiru prozesuk "erdi-erreserbatutako kopia-kate" gehiago lor dezakete, eta kate berri hau eskuragarri dago berriro Bihurtu hurrengo ziklorako txantiloi.2-4min behar dira begizta osatzeko, xede-genea hainbat milioi aldiz anplifikatu daiteke 2-3 ordutan.

EstandarraPCRErreakzio-sistema

PCR erreakzioaren bost elementu

PCR erreakzioan parte hartzen duten bost substantzia mota daude batez ere, hau da, primer, entzima, dNTP, txantiloia eta buffer (Mg2+ behar da).[PCR prozedura]

PCR prozesu estandarra hiru urratsetan banatzen da

1. DNAren endekapena (90°C-96°C): Akzio termikoko kate bikoitzeko DNA txantiloiak, hidrogeno-loturak hausten dira, kate bakarreko DNA osatuz.

2. Erretiroa (25 ℃ -65 ℃): sistemaren tenperatura murrizten da, abiarazlea DNA txantiloiarekin konbinatzen da kate bikoitz lokal bat osatzeko.

3. Hedapena (70 ℃ -75 ℃): Taq entzimaren (72 °C inguru, jarduerarik onena) eraginpean, dNTP lehengai gisa erabiltzen da, lehengaiaren 5′ muturretik hedatu → 3′ muturretik, sintesia eta txantiloiak DNA katearen osagarri dira.

Ziklo bakoitza desnaturalizatu, erreztatu eta hedatu egiten da, DNAren edukia bikoiztuz.Gaur egun, anplifikazio-eremu laburra dela eta, PCR batzuk oso denbora laburrean errepika daitezke, nahiz eta Taq entzimaren jarduera optimoa ez izan, beraz, bi urratsetara alda daiteke, hau da, 60°C-65°C-tan aldi berean egin daitezke errekostia eta luzapena.Altxatzeko eta hozteko prozesua murrizteko eta erantzun-abiadura hobetzeko.

PCR Erreakzioaren ezaugarriak

● Zehaztasun handikoa

PCR erantzunaren faktore erabakigarri espezifikoak hauek dira: ①Primeraren eta DNA txantiloiaren konbinazio espezifikoa.②Oinarrien parekatzearen printzipioa.③TaqDNA polimerasa sintesi erreakzioaren leialtasuna.④ Xede-genearen espezifikotasuna eta kontserbadorea.

Lehen eta txantiloien konbinazio zuzena da gakoa.Primera eta txantiloia lotzea eta hasierako katearen luzapena oinarri alkalinoen parekatzearen printzipioan oinarritzen dira.Polimerasaren sintesi erreakzioen leialtasuna eta Taq DNA polimerasaren tenperatura altuak erreakzio txantiloiaren eta abiarazlearen lotura (konposatua) egiteko tenperatura altuagoan egin daitezke.Konbinazioaren espezifikotasuna asko handitzen da.Klipak zuzentasun maila altua mantendu dezake.Kontserbatibotasun handiko eta kontserbagarritasun handiko xede-eskualde genetiko bat hautatuz gero, bere espezifikotasuna handiagoa da.

● Sentsibilitate Handia

PCR produktuen ekoizpen-bolumena indizearen bidez handitzen da, eta horrek Picker-en hasierako txantiloia (PG=10-12) zabaldu dezake mikrokontrolagailuaren maila mikrogramo mailara (μg= -6) handitzeko.Helburu-zelula bat milioi bat zelulatik detekta daiteke;birusen detekzioan, PCRren sentsibilitatea 3 RFUra irits daiteke (ordu hutsak eratutako unitateak);bakterioen zientzian detekzio-tasa minimoa 3 bakterio da.

● Sinplea eta Azkarra

PCR islatzeak tenperatura altuko Taq DNA polimerasa erabiltzen du, erreakzio-soluzioa aldi berean gehitzen duena, hau da, degenerazio-anneal-hedapen erreakzioa DNA anplifikatzeko soluzioan eta bainu-ontzian.Orokorrean, anplifikazio erreakzioa 2 eta 4 ordutan amaitzen da.Gehitutako produktuak, oro har, ezpata elektrikoaren bidez aztertzen dira, eta ez dute zertan isotoporik erabili behar, ez dute kutsadura erradioaktiborik eta sustapen erraza.

● Alearen purutasuna baxua da

Ez dago birusak edo bakterioak eta zelulak landatu beharrik.DNA produktu gordinak eta RNA anplifikatzaile gisa erabil daitezke.DNA anplifikatzeko detekzioa zuzenean erabil daiteke ale klinikoak erabiliz, hala nola odola, gorputz-likidoa, eztula garbitzeko likidoa, ilea, zelulak eta ehun bizia.

PCRohiko arazoak

● Negatibo faltsua, banda anplifikaturik ez

PCR erreakzioaren funtsezko faseak honako hauek dira: ① azido nukleiko txantiloiak prestatzea, ② abiarazleen kalitatea eta espezifikotasuna, ③ entzimen kalitatea ④ PCR zikloaren baldintzak.Arrazoia aurkitzea ere aztertu eta aztertu behar da goiko esteketarako.

Txantiloiak: ① Txantiloiak hainbat proteina ditu, ② Txantiloiak Taq entzimaren inhibitzailea dauka, ③ Txantiloiaren proteina ez da ezabatzen, batez ere kromosomako taldeko proteina.⑤ Deminer azido nukleikoaren endekapena ez da sakona.Entzimen eta primeren kalitatea ona denean, ez dago anplifikazio-bandarik, hau da, ziurrenik, aleen digestio-tratamendua.Txantiloi azido nukleikoen erauzketa prozesuan zerbait gaizki dago, beraz, digestio-soluzio eraginkor eta egonkorra prestatzeko, bere prozedura konpondu behar da eta ez arbitrarioki aldatu.

Entzimaren inaktibazioa: entzima berri bat edo entzima zaharrak eta berriak batera erabili behar dira entzimaren jarduera galtzen den edo nahikoa ez den aztertzeko, negatibo faltsuak eraginez.Kontuan izan behar da batzuetan Taq entzima edo etidio bromuroa ahaztu egiten dela.

Primer: inprimagailuaren kalitatea, inprimagailuaren kontzentrazioa eta bi inprimagailuen kontzentrazioa simetrikoa den.PCR hutsegitearen arrazoi arrunta da edo handitzen den banda ez da ideala eta hedatzeko joera.Lote-zenbaki batzuen inprimagailuen kalitatearekin arazoak daude.Bi primerek kontzentrazio handia eta kontzentrazio baxua dute, eta eraginkortasun baxuko anplifikazio asimetrikoa eragiten dute.Kontraneurriak hauek dira: ① Aukeratu primer on bat unitateak sintetizatzeko.② Primeraren kontzentrazioa OD balioaren araberakoa ez ezik, hasierako jatorrizko likidoari ere erreparatzen dio agar azukre gel elektroforesia egiteko.Primer-banda eremu bat egon behar da, eta bi primeren distira, oro har, koherentea izan behar da.Gerrikoa, PCR-k huts egin dezake une honetan, eta lehen sintesi-unitatearekin konpondu beharko litzateke.Primer bat altua bada, distira baxua da, eta bere kontzentrazioa orekatu behar da diluitzean.③ Primera kontzentrazio handian ordaindu eta gorde behar da hozkailuaren hainbat izozte edo epe luzerako hozte-zatiak saihesteko, eta horrek inprimaketa hondatzea eta degradatzea eragingo du.④ Primeraren diseinua zentzugabea da, esate baterako, primeraren luzera ez da nahikoa, eta di-klustera lehengaien artean eratzen da.

Mg2+kontzentrazioa: Mg2+ion kontzentrazioa PCR anplifikazio eraginkortasunean eragin handia du.Gehiegizko kontzentrazioek PCR anplifikazioaren kontrako sexua murriztu dezakete.Kontzentrazioa baxuegia bada, PCR anplifikazio-irteerak PCR anplifikazio-porrota ere egingo du hedapen-bandarik gabe.

Erreakzio bolumenaren aldaketa: PCR anplifikazioan erabiltzen den bolumena 20ul, 30ul eta 50ul edo 100ul da, PCR anplifikaziorako aplikazioaren bolumen handia ikerketa zientifikoen eta proba klinikoen helburu ezberdinen arabera ezartzen da.20ul bezalako bolumen txikiak egin ondoren, beharrezkoa da kablea baldintza egitea tamaina egiterakoan, bestela huts egingo du.

Arrazoi fisikoak: eraldaketa oso garrantzitsua da PCR anplifikaziorako.Endekapen-tenperatura baxua bada, endekapen-denbora laburra da, litekeena da negatibo faltsuetan gertatzea;errekostatzeko tenperatura baxuegiak anplifikazio ez-espezifikoa eragin dezake eta anplifikazio espezifikoaren eraginkortasuna murrizten du.Eragin handia abiarazteen eta txantiloien konbinazioari, PCR anplifikazioaren eraginkortasuna murrizteko.Batzuetan, beharrezkoa da termometro estandarrak erabiltzea luzapenean edo ur-disolbagarria den sukaldean aldakortasuna, errekostea eta tenperatura hedatua detektatzeko, hori baita PCRren porrotaren arrazoietako bat.

Xede-sekuentziaren aldaerak: xede-sekuentzia gertatzen bada, mutazio edo delezio bat, prototipoaren eta txantiloiaren konbinazioa konbinatzen bada, edo xede-sekuentziarik ez dagoelako, abiarazleak eta txantiloiak sekuentzia osagarria galduko dute, eta bere PCR anplifikazioa ez da arrakastatsua izango.

● Positibo faltsua

PCR anplifikazio-banda xede-sekuentzia-bandarekin koherentea dirudi, eta batzuetan bere banda txukunagoa eta altuagoa da.

Primer-diseinua ez da egokia: hautatutako anplifikazio-sekuentzia eta helbururik gabeko anplifikazio-sekuentzia homologoak dira, beraz, PCR anplifikazioan, anplifikatutako PCR produktuak helbururik gabeko sekuentziak dira.Helburu-sekuentzia laburregia da edo abiarazlea laburregia da, eta positibo faltsuak izateko joera du.Berriz diseinatu behar da.

Xede-sekuentziaren edo anplifikazio-produktuen kutsadura gurutzatua: Kutsadura honen arrazoi bi daude: Lehenengoa, genoma osoaren edo segmentu handien kutsadura gurutzatua, positibo faltsuak sorrarazten dituena.Positibo faltsu hau metodo hauen bidez ebatzi daiteke: Kontuz ibili eta emeki funtzionamenduan xede-sekuentzia lagin-pistolan arnastea edo hodi zentrifugotik zipriztintzea saihesteko.Tenperatura altuak jasan ezin dituzten entzimak eta substantziak izan ezik, erreaktibo edo ekipo guztiak presio altuarekin desinfektatu behar dira.Hodi zentrifugoak eta laginak aldi berean erabili behar dira.Beharrezkoa denean, aleak gehitu aurretik, erreakzio-hodia eta erreaktiboa izpi ultramoreen eraginpean jartzen dira lehendik dagoen azido nukleikoa suntsitzeko.Bigarrenik, airearen kutsaduraren zati txikiak.Zati txiki hauek xede-sekuentzia baino laburragoak dira, baina nolabaiteko homologia dute.Elkarrekin lotu daiteke.Primerak osatu ondoren, PCR produktua hedatu daiteke, eta horrek produkzio positibo faltsuak eragingo ditu.Habia PCR metodoa murrizteko edo ezabatzeko erabil daiteke.

● Anplifikazio-banda espezifikorik gabeko agertzea

PCR anplifikazioaren ondoren agertu ziren bandak ez datoz bat espero den tamainarekin, edo handiak edo txikiak, edo aldi berean, edo aldi berean, anplifikazio-banda espezifikoak eta anplifikazio-banda ez-espezifikoak.Banda ez-espezifikoen agerpena honakoa da: Lehenik eta behin, abiarazleak xede-sekuentziaren osagarri osatugabeak dira, edo abiaraztearen polimerizazioa di-kluster bat eratzeko.Bigarrena, MG2 + ioien kontzentrazioa altuegia dela, annealing tenperatura baxuegia dela eta PCR zikloen kopurua erlazionatuta dago.Bigarrenik, entzimen kalitatea eta kopurua.Askotan, iturri batzuen entzimek banda ez-bereziak izateko joera dute eta beste iturriko entzimak ez dira gertatzen.Batzuetan, entzimen anplifikazio ez-espezifikoa ere gertatzen da.Kontraneurriak hauek dira: behar izanez gero erakargarri birdiseinatuak.Murriztu entzima kopurua edo ordezkatu beste iturri bateko entzima.Murriztu lehen mailako kopurua, handitu txantiloien kopurua egokiro eta murriztu ziklo kopurua.Behar bezala handitu erretiro-tenperatura edo erabili bi tenperatura-puntuen metodoa (93 °C-ko endekapena, 65 °C inguruko errekuzitzea eta hedatzea).

● Atopa malutatsua edo zinta zinta agertzea

PCR anplifikazioa batzuetan aplikatzen edo oskolatuta edo alfonbra itxurako gerrikoa dirudi.Hori dela eta, entzimaren gehiegizko kantitatea edo entzimaren kalitate txarra dela eta, dNTP kontzentrazioa altuegia da, Mg2+ kontzentrazioa altuegia da, annealing tenperatura baxuegia da eta ziklo kopurua gehiegizkoa da.Kontraneurriak hauek dira: ①Entzima kopurua murriztea edo beste iturri bateko entzima aldatu.②Gutxitu dNTPren kontzentrazioa ③Mg2+ kontzentrazioa behar bezala murriztu.④Handitu txantiloien kopurua eta murriztu ziklo kopurua.

Lotutako produktuak

PCR Heroᵀᴹ (koloratzailearekin)

◮ Fideltasun handiagoa: Taq entzima arruntaren 6 aldiz;

◮ Anplifikazio abiadura azkarragoa

◮ Txantiloiaren moldagarritasun gehiago

◮ Anplifikazio-eraginkortasun handiagoa

◮ Ingurugiroarekiko tolerantzia sendoagoa da: astebetez 37°C-tan jarrita, jarduera %90 baino gehiago mantenduz;

◮ 5'→3' DNA polimerasa jarduera eta 5'→3' exonukleasa jarduera ditu, 3'→5' exonukleasa jarduerarik gabe.

PCR Easyᵀᴹ (koloratzailearekin)

Erreakzio-sistema bereziak eta eraginkortasun handiko Taq DNA Polimerasak PCR erreakzioak anplifikazio-eraginkortasun, espezifikotasun eta sentikortasun handiagoak ditu.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (One Step)-SYBR Green I

◮ Urrats bakarreko kit-ak alderantzizko transkripzioa eta qPCR bi erreakzio egiten ditu hodi berean, txantiloi RNA, PCR abiarazle espezifikoak eta RNasarik gabeko ddH bakarrik gehitu behar dira.₂O.

◮ Kitak RNA birikoa edo RNA arrastoa kuantitatiboki azter ditzake azkar eta eraginkortasunez.

◮ Kitak Foregene alderantzizko transkripzio erreaktibo berezia eta Foregene HotStar Taq DNA Polimerasa erabiltzen ditu erreakzio-sistema berezi batekin konbinatuta, erreakzioaren anplifikazio-efizientzia eta espezifikotasuna eraginkortasunez hobetzeko.

◮ Erreakzio-sistema optimizatuak erreakzioak detekzio-sentsibilitate handiagoa, egonkortasun termiko sendoagoa eta tolerantzia hobea izatea eragiten du.

◮ RT-qPCR Erraza^TM(One Step)-SYBR Green I kit-a ROX barneko erreferentziako koloratzailearekin dator, putzuen arteko seinalearen atzeko planoa eta seinale akatsak kentzeko erabil daitekeena, bezeroek PCR tresna kuantitatiboen eredu desberdinetan erabiltzeko erosoa dena.

RT Erraza^TMII (Master Aurrenahasketarako lehen katearen cDNA sintesirakoDenbora errealeko PCR)

-gDNA kentzeko gaitasun eraginkorra, txantiloian gDNA kendu dezakeena 2 minuturen buruan.

- Alderantzizko transkripzio-sistema eraginkorra, 15 minutu baino ez ditu behar lehen katearen cDNAren sintesia burutzeko.

-Txantiloi konplexuak: GC eduki handia eta egitura sekundario konplexua duten txantiloiak ere eraginkortasun handiz alderantzikatu daitezke.

-Sentikortasun handiko alderantzizko transkripzio-sistema, pg-mailako txantiloiak kalitate handiko cDNA ere lor dezakete.

- Alderantzizko transkripzio sistemak egonkortasun termiko handia du, erreakzio-tenperatura optimoa 42 ℃ da, eta alderantzizko transkripzio errendimendu ona du oraindik 50 ℃-tan.