一、Reakzio-sistemaren sentikortasuna handitu:

1. Kalitate handiko RNA isolatu:

cDNA sintesi arrakastatsua kalitate handiko RNAtik dator.Kalitate handiko RNAk gutxienez luzera eta alderantzizko transkriptasa inhibitzailerik gabekoa izan behar du, hala nola EDTA edo SDS.RNAren kalitateak cDNAra transkribatu dezakezun sekuentzia-informazio kopuru maximoa zehazten du.RNA arazteko metodo arrunta urrats bakarreko metodoa da, guanidina isotiozianatoa/fenol azidoa erabiliz.RNasaren aztarna kopuruak kutsatzea saihesteko, RNasan aberatsak diren laginetatik (pankreako adibidez) isolatutako RNA formaldehidoan gorde behar da kalitate handiko RNA kontserbatzeko, batez ere epe luzerako biltegiratzeko.Arratoiaren gibeletik ateratako RNAa, funtsean, astebetez uretan gorde ondoren degradatu zen, eta arratoiaren bareatik ateratako RNA egonkor mantendu zen, 3 urtez uretan gorde ondoren.Gainera, 4 kb baino luzeagoak diren transkripzioak transkripzio txikiak baino sentikorragoak dira aztarna RNasen degradaziorako.Biltegiratutako RNA laginen egonkortasuna areagotzeko, RNA formamida deionizatuan disolbatu eta -70 °C-tan gorde daiteke.RNA kontserbatzeko erabiltzen den formamida RNA degradatzen duten hondakinik gabe egon behar da.Pankreako RNA formamidan gorde daiteke gutxienez urtebetez.RNA erabiltzeko prestatzen ari zarenean, metodo hau erabil dezakezu RNA hauspeatzeko: gehitu NaCl 0,2M eta 4 aldiz etanolaren bolumena, jarri giro-tenperaturan 3-5 minutuz eta zentrifugatu 10.000×g-tan 5 minutuz.

2. Erabili RNaseH inaktiboa (RNaseH-) alderantzizko transkriptasa:

RNasaren inhibitzaileak sarritan gehitzen dira alderantzizko transkripzio erreakzioetan cDNA sintesiaren luzera eta etekina handitzeko.RNasaren inhibitzaileak lehen katearen sintesi-erreakzioan gehitu behar dira buffer baten eta agente erreduktore baten aurrean (adibidez, DTT), izan ere, cDNA-ren sintesiaren aurreko prozesuak inhibitzailea desnaturalizatzen du, horrela RNA degradatu dezakeen RNasa lotua askatuz.Protein RNasa inhibitzaileek RNasa A, B, C ARNaren degradazioa soilik saihesten dute eta ez dute RNasa larruazalean eragozten, beraz, kontuz ibili RNasa ez sartzeko hatzetatik inhibitzaile hauek erabili arren.

Alderantzizko transkriptasak RNA cDNA bihurtzea katalizatzen du.Bi M-MLV eta AMV-k RNaseH jarduera endogenoa dute polimerasaren jardueraz gain.RNasaH jarduera eta polimerasa jarduera elkarren artean lehiatzen dira RNA txantiloiaren eta DNA-ren abiaraztearen edo cDNA hedapen-katearen artean sortutako kate hibridoagatik, eta RNA:DNA konplexuan RNA katea degradatzen dute.RNaseH jarduerak degradatutako RNA txantiloiak ezin du jada cDNA sintesirako substratu eraginkor gisa balio, eta horrek cDNA sintesiaren etekina eta luzera murrizten ditu.Beraz, alderantzizko transkriptasaren RNaseH jarduera kentzea edo asko murriztea onuragarria izango litzateke.。

SuperScript Ⅱ alderantzizko transkriptasak, RNaseH- MMLV alderantzizko transkriptasak eta thermoScript alderantzizko transkriptasak, RNaseH- AMV, MMLV eta AMV baino cDNA kopuru gehiago eta luzera gehiago lor dezakete.RT-PCR sentikortasuna cDNA-ren sintesi kopuruaren arabera izango da.ThermoScript AMV baino askoz sentikorragoa da.RT-PCR produktuen tamaina alderantzizko transkriptasak cDNA sintetizatzeko duen gaitasunak mugatzen du, batez ere cDNA handiagoak klonatzen direnean.MMLV-rekin alderatuta, SuperScripⅡ nabarmen handitu zuen RT-PCR produktu luzeen etekina.RNaseH-alderantzizko transkriptasak ere termoegonkortasuna areagotu du, beraz, erreakzioa ohiko 37-42 °C baino tenperatura altuagoetan egin daiteke.Iradokitako sintesi baldintzetan, erabili oligo(dT) primer eta [α-P]dCTP 10 μCi.Lehenengo hariaren etekin osoa TCA prezipitazio metodoa erabiliz kalkulatu da.Luzera osoko cDNA aztertu zen, neurrian sailkatutako bandak erabiliz, agarosa gel alkalino batean moztutako eta zenbatu.

3. Igotu inkubazio-tenperatura alderantzizko transkripziorako:

Inkubazio-tenperatura handiagoak RNA egitura sekundarioa irekitzen laguntzen du, erreakzioaren etekina handituz.RNA txantiloi gehienentzat, RNA eta abiarazleak 65 °C-tan inkubatzeak tampon edo gatzik gabe, eta ondoren izotzean azkar hozteak egitura sekundario gehienak ezabatuko ditu eta abiarazleei lotzea ahalbidetuko die.Hala ere, txantiloi batzuek bigarren mailako egiturak dituzte oraindik, nahiz eta bero desnaturalizatu ondoren.Txantiloi zail hauen anplifikazioa ThermoScript Reverse Transcriptase erabiliz egin daiteke eta alderantzizko transkripzio erreakzioa tenperatura altuagoan jarriz anplifikazioa hobetzeko.Inkubazio-tenperatura altuagoek espezifikotasuna ere areagotu dezakete, batez ere geneen espezifikoak (GSP) cDNA sintesirako erabiltzen direnean (ikus 3. kapitulua).GSP erabiltzen baduzu, ziurtatu hasierako Tm espero den inkubazio-tenperaturaren berdina dela.Ez erabili oligo(dT) eta ausazko lehengaiak 60 °C-tik gora.Ausazko hasierak 25 °C-tan inkubatzea behar dute 10 minutuz 60 °C-ra igo aurretik.Alderantzizko transkripzio-tenperatura altuagoa erabiltzeaz gain, espezifikotasuna ere hobetu daiteke RNA/primer nahasketa zuzenean transferituz 65 °C-ko desnaturalizazio-tenperaturatik alderantzizko transkripzio-inkubazio-tenperaturara eta aurrez berotutako 2× erreakzio-nahasketa gehituz (cDNA hot-start sintesia).Ikuspegi honek tenperatura baxuagoetan gertatzen den molekulen arteko base parekatzea saihesten laguntzen du.RT-PCRrako beharrezkoa den tenperatura aldaketa anitz sinplifikatu daiteke termoziklatu bat erabiliz.

Tth polimerasa termoegonkorrak DNA polimerasa gisa jokatzen du Mg2+-ren aurrean eta ARN polimerasa gisa Mn2+-ren aurrean.Bero mantendu daiteke 65 °C-ko gehienezko tenperaturan.Hala ere, PCRn Mn2+-ren presentziak fideltasuna murrizten du, eta horrek Tth polimerasa ez da hain egokia doitasun handiko anplifikaziorako, hala nola cDNA klonatzeko.Gainera, Tth-k alderantzizko transkripzioaren eraginkortasun txikia du, sentsibilitatea murrizten duena, eta, alderantzizko transkripzioa eta PCR entzima bakarrarekin egin daitezkeenez, alderantzizko transkripziorik gabeko kontrol-erreakzioak ezin dira erabili cDNA anplifikatzeko produktuak DNA genomiko kutsagarriarekin alderatzeko.Anplifikazio produktuak bereizi ziren.

4. Alderantzizko transkripzioa sustatzen duten gehigarriak:

Glizerola eta DMSO barne gehigarriak gehitzen zaizkio lehen katearen sintesi-erreakzioari, eta horrek azido nukleikoaren egonkortasuna murrizteko eta RNAren bigarren mailako egitura askatu dezake.Gehienez %20 glizerola edo %10 DMSO gehi daiteke SuperScript II edo MMLV jarduerari eragin gabe.AMV-k ere %20ko glizerola jasan dezake jarduera galdu gabe.SuperScriptⅡ alderantzizko transkripzio erreakzioan RT-PCRren sentsibilitatea maximizatzeko, % 10 glizerola gehi daiteke eta 45 °C-tan inkubatu.PCRri alderantzizko transkripzio erreakzioaren produktuaren 1/10 gehitzen bazaio, orduan anplifikazio-erreakzioan glizerolaren kontzentrazioa % 0,4 da, eta hori ez da nahikoa PCR inhibitzeko.

5. RNaseH tratamendua:

PCRren aurretik RNaseH-rekin cDNA sintesi erreakzioen tratamenduak sentsibilitatea areagotu dezake.Txantiloi batzuetarako, uste da cDNA sintesi erreakzioan RNAk anplifikazio produktuen lotura eragozten duela, eta kasu horretan, RNaseH tratamenduak sentsibilitatea areagotu dezake.Orokorrean, RNaseH tratamendua beharrezkoa da luzera osoko cDNA xede txantiloiak anplifikatzen direnean, hala nola kopia baxuko eskerosi tuberosa II.Txantiloi zail honetarako, RNaseH tratamenduak SuperScript II edo AMV-sintetizatutako cDNAk sortutako seinalea hobetu zuen.RT-PCR erreakzio gehienetarako, RNaseH tratamendua hautazkoa da, izan ere, 95 °C-tan PCR desnaturalizazio urratsak RNA:DNA konplexuan hidrolizatzen baitu.

6. RNA txikia detektatzeko metodoa hobetzea:

RT-PCR bereziki zaila da RNA kantitate txikiak soilik daudenean.RNA isolatzean eramaile gisa gehitutako glukogenoak lagin txikien etekina handitzen laguntzen du.RNasarik gabeko glukogenoa gehi daiteke Trizol gehitzearekin batera.Glikogenoa ur disolbagarria da eta ur-fasean gorde daiteke RNArekin, ondorengo prezipitazioa laguntzeko.50 mg ehun edo 106 zelula hazi baino gutxiagoko laginetarako, RNasarik gabeko glukogenoaren kontzentrazioa 250 μg/ml da.

SuperScript II erabiliz alderantzizko transkripzio erreakzioari BSA azetilatua gehitzeak sentsibilitatea areagotu dezake, eta RNA kantitate txikietarako, SuperScript II kopurua murriztea eta RNaseOut nukleasa inhibitzailearen 40 unitate gehitzea detekzio maila handitu daiteke.RNA isolatzeko prozesuan glukogenoa erabiltzen bada, oraindik ere gomendatzen da BSA edo RNasa inhibitzailea gehitzea SuperScript II erabiltzean alderantzizko transkripzio erreakziorako.

二、 RT-PCR espezifikotasuna handitzea

1. CND asintesia:

Lehen katearen cDNA-ren sintesia hiru metodo ezberdin erabiliz abiarazi daiteke, eta horien espezifikotasun erlatiboak sintetizatutako cDNA kantitatean eta motan eragiten du.

Ausazko primer metodoa hiru metodoetatik espezifikoena izan zen.Primerak transkripzioan zehar hainbat gunetan errekutatzen dira, eta luzera partzialeko cDNA laburrak sortzen dituzte.Metodo hau maiz erabiltzen da 5′ amaierako sekuentziak lortzeko eta egitura sekundarioko eskualdeak dituzten edo alderantzizko transkriptasa bidez erreplikatu ezin diren amaiera guneak dituzten RNA txantiloietatik cDNA lortzeko.cDNA luzeena lortzeko, ARN lagin bakoitzeko abiarazleen eta ARNaren arteko erlazioa enpirikoki zehaztu behar da.Ausazko primeren hasierako kontzentrazioa 20 μl erreakzio bakoitzeko 50 eta 250 ng bitartekoa zen.Ausazko abiarazleak erabiliz ARN osotik sintetizatutako cDNA batez ere RNA erribosomikoa denez, poli(A)+RNA aukeratzen da orokorrean txantiloi gisa.

Oligo(dT) abiarazleak ausazko lehenak baino espezifikoagoak dira.MRNA eukarioto gehienen 3′ amaieran aurkitzen den poli(A) isatsarekin hibridatzen da.Poli(A)+ RNA RNA osoaren %1etik %2ra gutxi gorabehera, cDNAren kantitatea eta konplexutasuna ausazko lehengaiekin baino askoz txikiagoa da.Bere espezifikotasun handia dela eta, oligo(dT) oro har ez du RNA-ren abiarazteen arteko erlazioa eta poli(A)+ hautapena optimizatu behar.20μl erreakzio sistema bakoitzeko 0,5μg oligo(dT) erabiltzea gomendatzen da.oligo(dT)12-18 egokia da RT-PCR gehienetarako.ThermoScript RT-PCR Sistemak oligo(dT)20 eskaintzen du inkubazio tenperatura altuagoetarako egonkortasun termiko hobea delako.

Gene specific primers (GSP) alderantzizko transkripzio-pausorako abiarazle espezifikoenak dira.GSP zentzuaren aurkako oligonukleotido bat da, RNA xede-sekuentziarekin bereziki hibridatu daitekeena, ausazko abiarazle edo oligo(dT) ez bezala, RNA guztiei erantzuten dietenak.PCR abiarazleak diseinatzeko erabiltzen diren arau berdinak GSPren diseinuari aplikatzen zaizkio alderantzizko transkripzio erreakzioetan.GSP mRNAren 3′-ko muturreraino estutzen den anplifikazio-hastapenaren sekuentzia bera izan daiteke, edo GSP-a alderantzizko anplifikazio-hastapenetik behera uzteko diseinatu daiteke.Anplifikatutako subjektu batzuentzat, zentzuaren aurkako primer bat baino gehiago diseinatu behar da RT-PCR arrakastatsua izateko, xede RNAren egitura sekundarioak primer lotzea eragotzi dezakeelako.Gomendatzen da 1 pmol antisentent GSP erabiltzea 20 μl lehen katearen sintesi erreakzio batean.

2. Igotu inkubazio-tenperatura alderantzizko transkripziorako:

GSP espezifikotasunaren abantaila osoa aprobetxatzeko, termoegonkortasun handiagoa duen alderantzizko transkriptasa bat erabili behar da.Alderantzizko transkriptasa termoegonkorrak tenperatura altuagoetan inkubatu daitezke erreakzioaren zorroztasuna areagotzeko.Esate baterako, GSP bat 55 °C-tan errekutatzen bada, GSParen espezifikotasuna ez da guztiz erabiliko AMV edo M-MLV alderantzizko transkripziorako 37 °C-ko zorroztasun baxuan erabiltzen bada.Hala ere, SuperScript II eta ThermoScript 50 °C-tan edo handiagoan erreakzionatu daitezke, eta horrek tenperatura baxuagoetan sortutako produktu ez-espezifikoak ezabatuko ditu.Gehieneko espezifikotasuna lortzeko, RNA/primer nahasketa zuzenean transferi daiteke 65 °C-ko desnaturalizazio-tenperaturatik alderantzizko transkripzio-inkubazio-tenperaturara eta aurrez berotutako 2× erreakzio-nahasketa batera gehi daiteke (cDNA sintesiaren hasiera beroa).Horrek tenperatura baxuetan molekula arteko base parekatzea saihesten du.RT-PCRrako beharrezkoak diren tenperatura-trantsizio anitz sinplifikatu daitezke ziklogailu termiko bat erabiliz.

3. DNA genomikoaren kutsadura murrizten du:

RT-PCRrekin topatzen duen balizko zailtasun bat RNAn DNA genomikoaren kutsadura da.RNA isolatzeko metodo on bat erabiliz, Trizol Erreaktiboa adibidez, RNA prestaketa kutsatzen duen DNA genomikoaren kopurua murriztuko da.DNA genomikotik eratorritako produktuak saihesteko, RNA anplifikazio-mailako DNasarekin trata daiteke, alderantzizko transkripzioa egin aurretik DNA kutsagarria kentzeko.DNasa I digestioa amaitu zen laginak 2,0 mM EDTAn inkubatuz 10 minutuz 65 °C-tan.EDTAk magnesio ioiak kelatu ditzake, tenperatura altuetan magnesio ioiaren menpeko RNA hidrolisia saihestuz.

Anplifikatutako cDNA DNA genomikoaren anplifikazio produktu kutsagarrietatik bereizteko, bakoitzak exoiak bereizteko lehengaiak diseinatu daitezke.cDNAtik eratorritako PCR produktuak kutsatutako DNA genomikotik eratorritakoak baino laburragoak izango dira.Horrez gain, ARN txantiloi bakoitzean alderantzizko transkripziorik gabeko kontrol-esperimentu bat egin zen, zati jakin bat DNA genomikotik edo cDNAtik eratorri zen zehazteko.Alderantzizko transkripziorik gabe lortutako PCR produktua genomatik eratorria da.