Uste dut denek beti topatuko dutela halako edo halako arazoak PCR erreakzioak egiterakoan, baina gehienak bi arazo nagusitan sailka daitezke:

Gene txantiloiaren anplifikazio txikiegia (anplifikazioa);
Xede gabeko geneen anplifikazio gehiegi.
Gehigarriak erabiltzea da arazo horiek konpontzeko ohiko estrategietako bat.Normalean, gehigarrien eginkizunak bi alderdi ditu:
bigarren mailako egiturageneak (bigarren mailako egitura);
Priming ez-espezifikoa murriztea.
Gaur, editoreak laburki aurkeztuko dizkizu PCR erreakzioetako gehigarri arruntak eta haien funtzioak.
Bigarren mailako egitura murrizten duten gehigarriak
sulfoxidoa(DMSO)
gene laginakGC eduki handia duena.Hala ere, DMSOk Taq polimerasaren jarduera ere asko murrizten du.Hori dela eta, denek orekatu behar dute txantiloiaren irisgarritasuna eta polimerasaren jarduera.Editoreak iradokitzen du DSMO kontzentrazio desberdinak proba ditzakezula, adibidez, %2tik %10era, zure esperimentuari egokitzen zaion kontzentrazioa aurkitzeko.
Garbigarri ez-ionikoak
Garbigarri ez-ionikoek, adibidez, % 0,1-1 Triton X-100, Tween 20 edo NP-40, normalean DNAren bigarren mailako egitura murrizten dute.Honek txantiloiaren genearen anplifikazioa areagotu dezakeen arren, anplifikazio ez-espezifikoaren arazoak ere eragingo ditu.Beraz, gehigarri hauek ondo funtzionatzen dute errendimendu baxuko PCR erreakzioetan hondakinik gabe, baina ez hain ondo PRC erreakzio nahiko ezpuruetarako.Garbigarri ez-ionikoen beste onura bat SDS kutsadura murriztea da.Normalean DNA erauzteko prozesuan, SDS PCR urratsera eramango da, eta horrek polimerasaren jarduera asko inhibitzen du.Hori dela eta, erreakzioari Tween-20 edo Tween-40 % 0,5 gehitzeak SDSren efektu negatiboak neutraliza ditzake.
Betaine_
Betainak DNAren anplifikazioa hobe dezake egitura sekundarioaren eraketa murriztuz eta, oro har, PCR kit komertzialen gain "misterioa" da.Betaina erabili nahi baduzu, betaina edo betaina monohidratoa jarri behar duzu (Betaina edo Betaina monohidratoa), baina ez betaina klorhidratoa (Betaina HCl), egokitu 1-1,7M-ko azken kontzentraziora.Betainak ere espezifikotasuna hobetzen lagun dezake, DNA urtzearen/DNA desnaturalizazioaren oinarrizko bikoteen konposizioaren menpekotasuna ezabatzen duelako.
Priming ez-espezifikoa murrizteko gehigarriak
Formamida
Formamida normalean erabiltzen den PCR gehigarri organikoa da.DNAren zirrikitu handiarekin eta zirrikitu txikiarekin konbinatu daiteke, eta, ondorioz, DNA maisuaren helize bikoitzaren egonkortasuna murrizten du eta DNAren urtze-tenperatura jaitsi.PCR esperimentuetan erabiltzen den formamidaren kontzentrazioa % 1-5 izan ohi da.
Tetrametiloaamonio kloruroa( TMAC)
Tetrametilamonio kloruroak hibridazioaren espezifikotasuna areagotu dezake (hibridazio espezifikotasuna) eta DNAren urtze-tenperatura handitu dezake.Horrela, TMAC-ek lehengai ez-espezifikoa kendu eta DNAren eta RNAren lotura okerrak murrizten ditu.Erabiltzen baduzuprimer endekatuakPCR erreakzioan, gogoratu TMAC gehitzea, normalean 15-100mM-ko kontzentrazioan erabiltzen dena.
Beste gehigarri arruntak
Goian aipatutako bi gehigarri kategoriez gain, ohiko gehigarri asko daude PCR erreakzioetan, funtzio desberdinak dituzten arren, oso garrantzitsuak dira.
Magnesio ioia
Magnesio ioia polimerasaren ezinbesteko kofaktore (kofaktorea) da, hau da, magnesio ioirik gabe polimerasa inaktiboa da.Hala ere, magnesio-ioi gehiegizko polimerasaren eraginkortasunean ere eragin dezake.PCR erreakzio bakoitzean magnesio ioien kontzentrazioa aldatu egingo da.Agente kelatzaileak (adibidez, EDTA edo zitratoa), dNTP eta proteinen kontzentrazioek magnesio ioien kontzentrazioan eragiten dute.Beraz, PCR esperimentuarekin arazoak badituzu, magnesio ioien kontzentrazio desberdinak aldatzen saia zaitezke, adibidez, 1.0-tik 4.0mM-ra, 0.5-1mM arteko tartearekin.
Azpimarratzekoa da izozte-desizozte ziklo anitzek magnesio kloruroaren disoluzioaren kontzentrazio estratifikazioa ekar dezaketela.Hori dela eta, guztiz disolbatu behar duzu erabili aurretik, eta ondo nahastu erabili aurretik.
Behi-serum albumina(Behi-albumina, BSA)
Kimika molekularreko esperimentuetan, behi-serum albumina oso gehigarri arrunta da, batez ere murrizketa entzimaren digestioan eta PCR esperimentuetan.PCR erreakzioetan, BSA lagungarria da konposatu fenolikoak bezalako kutsatzaileak murrizteko.Eta saio-hodiaren horman erreaktiboen atxikimendua murrizten duela ere esaten da.PCR erreakzioan, normalean gehitutako BSAren kontzentrazioa 0,8 mg/ml izatera irits daiteke.
 
Erlazionatutako produktuak:
PCR Hero(koloratzailearekin)
PCR Hero