qPCR esperimentuetan, lehen diseinua ere lotura oso garrantzitsua da.Primerak egokiak diren ala ez oso lotuta dago anplifikazio-eraginkortasuna estandarrera iristen den, anplifikatutako produktuak espezifikoak diren eta emaitza esperimentalak eskuragarri dauden ala ez.
Beraz, nola hobetu qPCR primer espezifikotasuna?Anplifikazio-eraginkortasun handia?
Gaur, qPCR lehengaiak elkarrekin diseinatzera eramango zaituztegu, eta qPCR hasierako diseinua esperimentuetan trebetasun eraginkor bat bilakatzen utziko dizugu.
qPCR abiarazleak diseinatzerakoan, normalean, arreta jarri behar da puntu hauei: introietan ahalik eta gehien diseinatu behar dira, produktuaren luzera 100-300 bp izan behar da, Tm balioa 60 °C-tik ahalik eta gertuen egon behar da, eta gorako eta beherako lehenak ahalik eta hurbilen egon behar dira, eta primeraren amaiera G edo C izan behar da, etab.
1. Introiak barne hartzen dituzten lehengaien diseinua
qPCR abiarazleak diseinatzean, introietan zehar diseinatutako abiarazleak aukeratzeak gDNA txantiloia anplifikatzea eragotzi dezake, eta produktu guztiak cDNAren anplifikaziotik eratorritakoak dira, horrela gDNAren kutsaduraren eragina ezabatuz.
2. Primer luzera
Primeraren luzera, oro har, 18-30 nt artekoa da, eta anplifikazio-produktuaren luzera 100-300 bp artean kontrolatu behar da ahalik eta gehien.
Primera laburregia bada, anplifikazio ez-espezifikoa ekarriko du, eta luzeegia bada, bigarren mailako egitura erraz osatuko du (adibidez, ilearen egitura).Anplifikazio-produktua luzeegia bada, ez da egokia polimerasaren erreakziorako, eta horrek PCR anplifikazioaren eraginkortasuna eragingo du.
3. GC edukia eta Tm balioa
Primeren GC edukia % 40 eta % 60 artean kontrolatu behar da.Oso altua edo baxuegia bada, ez da erreakzioa abiarazteko mesedegarria.Aurrerako eta alderantzizko abiarazteen GC edukia berdinetik hurbil egon behar da Tm balio eta errekostatzeko tenperatura berdina lortzeko.
Tm balioak 55-65 °C artean egon behar du ahal den neurrian, orokorrean 60 °C ingurukoa, eta gora eta beherako Tm balioak ahalik eta hurbilen egon behar du, ahal dela 4 °C baino gehiago.
4. Saihestu A hautatzea primeraren 3′ amaieran
Primeraren 3′ muturra bat ez datorrenean, desberdintasun handiak daude base ezberdinen sintesi-eraginkortasunean.Azken oinarria A denean, katearen sintesia ere abiarazi dezake bat ez datozenean ere, eta azken oinarria T denean, desadostasun-indukzioaren eraginkortasuna asko murrizten da.Hori dela eta, saihestu saihestu A aukeratzen inprimagailuaren 3′ amaieran, eta hobe da T aukeratzea.
Zunda-abiarazlea bada, zundaren 5′ muturra ezin da G izan, izan ere, G base bakar bat FAM berriemaile fluoreszenteen taldearekin konektatzen denean ere, G-k FAM taldeak igorritako seinale fluoreszentea itzal dezake, emaitza negatibo faltsuak eraginez.Agertu.
5. Oinarrizko banaketa
Primeran lau oinarrien banaketa ausazkoa da, 3' muturrean jarraian 3 G edo C baino gehiago saihestuz, eta jarraian 3 baino gehiago.G edo C parekatzea errazak dira GC-n aberatsa den sekuentzia eskualdean.
6. Lehen diseinu-eskualdeak bigarren mailako egitura konplexuak saihestu behar ditu.
Anplifikazio-produktuaren hari bakarrak osatutako bigarren mailako egiturak PCRren aurrerapen leunean eragingo du.Xede-sekuentzian aldez aurretik egitura sekundariorik ba ote dagoen aurreikusiz, saia zaitez eskualde hori saihesten abiarazteen diseinuan.
7. Primerak beraiek eta abiarazleen artekoak ondoz ondoko oinarri osagarriak saihesten saiatu behar dute.
Ezin da 4 base osagarri jarraian egon primeraren beraren eta primeraren artean.Primerak berak ez luke sekuentzia osagarririk izan behar, bestela, bere burua tolestuko da ile-egitura bat osatzeko, eta horrek primeraren eta txantiloiaren errekuntza konbinazioari eragingo dio.
Sekuentzia osagarriak ezin dira egon upstream eta downstream primeren artean.Hastapenen arteko osagarritasunak primer-dimeroak sortuko ditu, eta horrek PCR eraginkortasuna murriztuko du eta zehaztasun kuantitatiboa ere eragingo du.Primer-dimero eta ilearen egiturak saihestezinak badira, △G balioa ez da oso altua izan behar (4,5 kcal/mol baino txikiagoa izan behar du).
8. Primerek xede-produktu espezifikoa handitzen dute.
qPCR detektatzeko azken helburua xede genearen ugaritasuna ulertzea da.Anplifikazio ez-espezifikoa gertatzen bada, kuantifikazioa ez da zehatza izango.Hori dela eta, abiarazleak diseinatu ondoren, BLAST-ek probatu behar ditu, eta produktuen espezifikotasuna sekuentzia datu-basean konparatzen da.
Ondoren, giza GAS6 (Growth stop specific 6) genea hartuko dugu adibide gisa qPCR abiarazleak diseinatzeko.
01 kontsulta genea
Homo GAS6NCBIren bitartez.Hemen, gene-izena eta espezieak alderatzean arreta jarri beharko genuke, koherenteak direla ziurtatzeko.
02 Aurkitu gene-sekuentzia
(1) Xede-sekuentzia DNA genomikoa bada, hautatu lehenengoa, hau da, genearen DNA genomikoaren sekuentzia.
(2) Xede-sekuentzia mRNA bada, hautatu bigarrena.Sartu ondoren, egin klik beheko taulan "CDS".Hondo marroiaren sekuentzia genearen sekuentzia kodetzailea da.
03 Diseinatzeko lehengaiak
Sartu Primer-BLAST interfazean
Sartu gene-sekuentzia-zenbakia edo sekuentzia Fasta formatuan goiko ezkerrean, eta bete dagokion parametroak.

Sakatu "Lortu primers" eta NCBI agertuko da parametro-hautaketa hori beste splicing aldaera batzuetara zabalduko dela esateko.Splicing-aldaera desberdinak egiazta ditzakegu eta aurkez ditzakegu hasiera-pare egokia lortzeko (beheko irudian ikusten den bezala).Prozesu honek hamar segundo behar izan ditzake martxan.
Primer-bikote hauen ontze-tenperaturak 60 °C ingurukoak dira.Esperimentuaren helburuaren arabera, aukeratu esperimenturako abiarazleen luzera moderatua, espezifikotasun ona eta auto-osagarri gutxiago duten abiarazleak, eta arrakasta-tasa nahiko altua da!
04Lehenen espezifikotasuna egiaztatzea
Izan ere, primer-ak diseinatzeaz gain, Primer-Blast-ek guk geuk diseinatutako inprimaketak ere ebalua ditzake.Itzuli lehen-diseinu-orrira, sartu guk diseinatutako korronte eta beheranzko lehen-ak, eta beste parametro batzuk ez dira egokituko.Bidali ondoren, ikus dezakezu primer parea beste geneetan ere baden.Horiek guztiak anplifikatu nahi dugun genean bistaratzen badira, lehen pare honen espezifikotasuna handia dela adieraziz!(Adibidez, hau da hasierako kontsultaren emaitza bakarra!)

05 Primer kalitatearen epaia
Zer motatako abiarazlea da "anplifikazio-eraginkortasuna estandarreraino", "produktuaren ezaugarri anplifikatu" eta "emaitza esperimental fidagarriak" konbinatzen dituen abiarazte "perfektua"?
Anplifikazio-eraginkortasuna

urtze-kurba
Primeren anplifikazio-eraginkortasuna %90-110era iristen da, hau da, anplifikazio-eraginkortasuna ona da, eta urtze-kurbak gailur bakarra du eta normalean Tm> 80 °C, hau da, anplifikazio espezifikotasuna ona da.
 
Erlazionatutako produktuak:
Denbora errealeko PCR Erraza–SYBR GREEN I
Denbora errealeko PCR Easy-Taqman