Ct balioa PCR kuantitatibo fluoreszentearen emaitza aurkezteko forma garrantzitsuena da.Geneen adierazpen-diferentziak edo gene kopia kopurua kalkulatzeko erabiltzen da.Beraz, zein da fluoreszentzia-kuantifikazioaren Ct balioa arrazoizkoa dela?Nola ziurtatu Ct balioaren barruti eraginkorra?
Zer da Ct balioa?
qPCR anplifikazio-prozesuan, dagokion anplifikazio-ziklo kopurua (Cycle Threshold) anplifikatutako produktuaren fluoreszentzia-seinalea ezarritako fluoreszentzia-atalasera iristen denean.C zikloa eta T atalasea esan nahi du.Besterik gabe, Ct balioa hasierako txantiloiaren anplifikazioa qPCR-n produktu kopuru jakin batera iristen denean dagokion ziklo-kopurua da."Produktu kopuru bat" deitzen dena aurrerago azalduko da.
Zer egiten du Ct balioak?
1.Anplifikazio esponentzialaren, txantiloiaren zenbatekoaren eta Ct balioaren arteko erlazioa
Egokiena, qPCR-n geneak anplifikazio esponentzialaren bidez metatzen dira ziklo kopuru jakin baten ondoren.Anplifikazio-ziklo-kopuruaren eta produktu-kopuruaren arteko erlazioa hauxe da: Produktu anplifikatu-kopurua = hasierako txantiloi-kopurua × (1+En) ziklo-kopurua.Hala ere, qPCR erreakzioa ez dago beti egoera ideal batean.Anplifikatutako produktuaren kantitatea "produktu kopuru jakin batera" iristen denean, une honetan ziklo-kopurua Ct balioa da, eta anplifikazio esponentzialeko periodoan dago.Ct balioaren eta hasierako txantiloiaren zenbatekoaren arteko erlazioa: Erlazio lineala dago txantiloiaren Ct balioaren eta txantiloiaren hasierako kopiaren zenbakiaren logaritmoaren artean.Hasierako txantiloiaren kontzentrazioa zenbat eta handiagoa izan, orduan eta txikiagoa izango da Ct balioa;zenbat eta txikiagoa izan hasierako txantiloiaren kontzentrazioa, orduan eta handiagoa izango da Ct balioa.
2.Anplifikazio kurba, fluoreszentzia atalasea eta PCR produktuaren kopuru jakin bat
qPCR anplifikazio-produktuaren kantitatea zuzenean aurkezten da seinale fluoreszente moduan, hau da, anplifikazio-kurba.PCRaren hasierako fasean, anplifikazioa baldintza ezin hobeetan dago, ziklo kopurua txikia da, produktuaren metaketa txikia da eta fluoreszentzia maila ezin da fluoreszentzia atzeko planotik argi bereizi.Horren ondoren, fluoreszentzia handitu eta fase esponentzialean sartzen da.PCR produktuaren kantitatea puntu jakin batean hauteman daiteke PCR erreakzioa fase esponentzialean dagoenean, eta hori "produktu kopuru jakin bat" gisa erabil daiteke, eta hortik ondoriozta daiteke txantiloiaren hasierako edukia.Hori dela eta, produktu kopuru jakin bati dagokion fluoreszentzia seinalearen intentsitatea fluoreszentzia atalasea da.
PCRren azken fasean, anplifikazio-kurbak jada ez du anplifikazio esponentziala erakusten, eta fase linealean eta meseta fasean sartzen da.
3.Ct balioen erreproduzigarritasuna
PCR zikloa Ct balioaren ziklo-zenbakira iristen denean, benetako anplifikazio-periodo esponentzialean sartu berri da.Une honetan, errore txikia ez da anplifikatu, beraz Ct balioaren erreproduzigarritasuna bikaina da, hau da, txantiloi bera aldi desberdinetan edo hodi desberdinetan aldi berean anplifikatzen da.Anplifikazioa, lortutako Ct balioa konstantea da.
1.Anplifikazio-eraginkortasuna En
PCR anplifikazio-eraginkortasuna polimerasak anplifikatu beharreko genea anplikoi batean bihurtzen duen eraginkortasunari esaten zaio.Anplifikazio-eraginkortasuna DNA molekula bat bi DNA molekulatan eraldatzen denean %100ekoa da.Anplifikazio-eraginkortasuna En gisa adierazten da normalean.Ondorengo artikuluen analisia errazteko, anplifikazio-eraginkortasunean eragiten duten faktoreak laburki azaltzen dira.
| Eragin-faktoreak | azalpena | Nola epaitu? |
| A. PCR inhibitzaileak | 1. DNA txantiloiak PCR erreakzioa inhibitzen duten substantziak ditu, hala nola proteinak edo detergenteak.2. Alderantzizko transkripzioaren ondoren cDNAk txantiloiaren RNA edo RT erreaktiboen osagaien kontzentrazio handia dauka, eta horrek ondorengo PCR erreakzioa galarazi dezake. | 1. Kutsadura dagoen ala ez A260/A280 eta A260/A230 edo RNA elektroforesiaren ratioa neurtuta epai daiteke.2. Alderantzizko transkripzioaren ondoren cDNA proportzio jakin baten arabera diluitzen den ala ez. |
| B. Primer diseinu desegokia | Primerak ez dira modu eraginkorrean erretzen | Egiaztatu primer-dimeroak edo ile-hornak, bat ez datozenak eta, batzuetan, diseinu intronikakoak. |
| C. PCR erreakzio programaren diseinu desegokia | 1. Primerek ezin dute modu eraginkorrean errekostu2. DNA polimerasa nahikoa askatzea 3. Epe luzerako tenperatura altuko DNA polimerasaren jarduera gutxitu egin zen | 1. Errekuzitzeko tenperatura primeraren TM balioa baino handiagoa da2. Desnaturalizazio aurreko denbora laburregia da 3. Erreakzio-prozeduraren etapa bakoitzaren denbora luzeegia da |
| D. Erreaktiboen nahasketa nahikoa ez izatea edo pipeteatzeko akatsak | Erreakzio-sisteman, PCR erreakzioaren osagaien tokiko kontzentrazioa altuegia edo irregularregia da, eta ondorioz, PCR anplifikazioaren anplifikazio ez-esponentziala da. | |
| E. Anplikonaren Luzera | Anplikoiaren luzera luzeegia da, 300bp gainditzen du, eta anplifikazio-eraginkortasuna baxua da | Egiaztatu anplikonaren luzera 80-300bp artekoa dela |
| F. qPCR erreaktiboen eragina | Erreaktiboko DNA polimerasaren kontzentrazioa baxua da edo buffer-eko ioien kontzentrazioa ez dago optimizatuta, eta ondorioz, Taq entzimaren jarduera ez da maximora iristen. | Anplifikazio-eraginkortasuna kurba estandarraren bidez zehaztea |
2.Ct balioen barrutia
Ct balioak 15-35 bitartekoak dira.Ct balioa 15 baino txikiagoa bada, anplifikazioa oinarrizko aldiaren barrutian dagoela eta fluoreszentzia-atalasea ez dela iritsitzat jotzen da.Egokiena, Ct balioaren eta txantiloiaren hasierako kopiaren zenbakiaren logaritmoaren artean erlazio lineala dago, hau da, kurba estandarraren artean.Kurba estandarraren bidez, anplifikazio-eraginkortasuna % 100ekoa denean, genearen kopia bakarraren zenbakia kuantifikatzeko kalkulatutako Ct balioa 35 ingurukoa da. 35 baino handiagoa bada, txantiloiaren hasierako kopia-zenbakia teorikoki 1 baino txikiagoa da, zentzurik gabekotzat jo daitekeena.
Gene Ct tarte desberdinetarako, gene kopia kopuruaren eta hasierako txantiloi-kopuruaren anplifikazio-eraginkortasunaren desberdintasuna dela eta, beharrezkoa da genearen kurba estandar bat egitea eta genearen detekzio-barruti lineala kalkulatzea.
3.Ct balioaren eragin-faktoreak
Anplifikazio-ziklo-kopuruaren eta produktu-kopuruaren arteko erlaziotik: produktu anplifikatuaren zenbatekoa = hasierako txantiloiaren zenbatekoa × (1+En) ziklo-zenbakia, ikusi daiteke baldintza idealetan, hasierako txantiloiaren eta En-kopuruak Ct balioan eragin negatiboa izango dutela.Txantiloiaren kalitatearen edo anplifikazioaren eraginkortasunaren aldeak Ct balioa handiegia edo txikiegia izatea eragingo du.
4.Ct balioa handiegia edo txikiegia da
Argitalpenaren ordua: 2023-02-22
