PCR (polimerasaren kate erreakzioa) in vitro DNA anplifikatzeko teknologietako bat da, 30 urte baino gehiagoko historia duena.

PCR teknologia AEBko Kary Mullis-ek aitzindari izan zuen Cetus-eko (AEB) 1983an. Mullis-ek PCR patente bat eskatu zuen 1985ean eta urte berean argitaratu zuen Zientziari buruzko PCRko lehen lan akademikoa.1993an Kimikako Nobel Saria eman zioten Mullisek bere lanagatik.

PCRren oinarrizko printzipioak

PCR-k helburuko DNA zatiak milioi bat aldiz baino gehiago handitu ditzake.Printzipioa DNA polimerasaren katalisiaren azpian dago, guraso-katearen DNA txantiloi gisa eta abiarazte espezifikoa luzapenerako abiapuntu gisa erabiliz.In vitro errepikatzen da desnaturalizazioa, annealing eta luzapena bezalako urratsen bidez.Kate alabaren DNAren prozesu nagusia katearen txantiloiaren DNAren osagarria.

PCR prozesu estandarra hiru urratsetan banatzen da:

1.Desnaturalizazioa: Tenperatura altua erabili DNA kate bikoitzak bereizteko.DNA kate bikoitzen arteko hidrogeno-lotura hausten da tenperatura altuan (93-98 ℃).

2.Annealing: Kate bikoitzeko DNA banandu ondoren, tenperatura jaitsi, abiarazlea kate bakarreko DNAri lotu ahal izateko.

3.Hedapena: DNA polimerasa hari osagarriak sintetizatzen hasten da DNA kateetan zehar loturiko abiarazteetatik tenperatura jaisten denean.Luzapena amaitzen denean, ziklo bat osatzen da, eta DNA zatien kopurua bikoiztu egiten da

Hiru urrats hauek 25-35 aldiz errepikatuz, DNA zatien kopurua esponentzialki handituko da.

PCRren asmamena zera da: abiarazte desberdinak xede-gene desberdinetarako diseina daitezkeela, xede-gene-zatiak denbora-tarte laburrean anplifikatu ahal izateko.

Orain arte, PCR hiru kategoriatan bana daiteke, hots, PCR arrunta, PCR kuantitatibo fluoreszentea eta PCR digitala.

PCR arruntaren lehen belaunaldia

Erabili PCR anplifikazio tresna arrunt bat xede genea anplifikatzeko, eta, ondoren, erabili agarosa gel elektroforesia produktua detektatzeko, analisi kualitatiboa bakarrik egin daiteke.

Lehen belaunaldiko PCRren desabantaila nagusiak:

1.Anplifikazio ez-espezifikoa eta emaitza positibo faltsuak izateko joera.

2.Detekzioak denbora luzea hartzen du eta eragiketa astuna da.

3.Proba kualitatiboa bakarrik egin daiteke

Bigarren belaunaldiko denbora errealeko PCR

Denbora errealeko PCR, qPCR izenez ere ezaguna, erreakzio-sistemaren aurrerapena adieraz dezaketen zunda fluoreszenteak erabiltzen ditu, eta anplifikatutako produktuen metaketa seinale fluoreszenteen metaketaren bidez kontrolatzen du eta emaitzak fluoreszentzia-kurbaren bidez epaitzen ditu.Cq balioaren eta kurba estandarraren laguntzaz kuantifikatu daiteke.

qPCR teknologia sistema itxi batean egiten denez, kutsatzeko probabilitatea murrizten da, eta fluoreszentzia seinalea detekzio kuantitatiboan kontrolatu daiteke, beraz, praktika klinikoan gehien erabiltzen dena da eta PCRn teknologia nagusi bihurtu da.

Denbora errealeko PCR kuantitatibo fluoreszentean erabiltzen diren substantzia fluoreszenteak honako hauetan bana daitezke: TaqMan zunda fluoreszentea, baliza molekularrak eta koloratzaile fluoreszentea.

1)TaqMan zunda fluoreszentea:

PCR anplifikazioan, zunda fluoreszente espezifiko bat gehitzen da primer pare bat gehitzen den bitartean.Zunda oligonukleotido bat da, eta bi muturrak talde fluoreszente berritzaile batekin eta talde fluoreszente itzaltzaile batekin markatuta daude.

Zunda osorik dagoenean, erreportari-taldeak igorritako seinale fluoreszentea itzaltze-taldeak xurgatzen du;PCR anplifikazioan, Taq entzimaren 5′-3′ exonukleasa jarduerak zunda mozten eta degradatzen du, talde fluoreszente berriemailea eta itzaltzailea eginez. PCR produktua.

2) SYBR koloratzaile fluoreszentea:

PCR erreakzio sisteman, SYBR koloratzaile fluoreszentearen gehiegizko bat gehitzen da.SYBR koloratzaile fluoreszentea DNA kate bikoitzean ez-espezifikoki sartu ondoren, seinale fluoreszente bat igortzen du.Katean sartzen ez den SYBR koloratzaile molekulak ez du seinale fluoreszenterik igorriko, eta horrela seinale fluoreszentea ziurtatzen du PCR produktuen hazkundea PCR produktuen gehikuntzarekin guztiz sinkronizatuta dago.SYBR kate bikoitzeko DNArekin soilik lotzen da, beraz, urtze-kurba erabil daiteke PCR erreakzioa espezifikoa den zehazteko.

3) Baliza molekularra:

Zurtoin-begizta etiketa bikoitzeko oligonukleotido zunda bat da, 5 eta 3 muturretan 8 base inguruko ile-egitura bat osatzen duena.Bi muturretako azido nukleikoen sekuentziak osagarri parekatuta daude, talde fluoreszentea eta itzaltze taldea estuak izatea eraginez.Itxi, ez da fluoreszentziarik sortuko.

PCR produktua sortu ondoren, annealing-prozesuan, baliza molekularraren erdiko zatia DNA sekuentzia zehatz batekin parekatzen da, eta gene fluoreszentea kencher genetik bereizten da fluoreszentzia sortzeko.

Bigarren belaunaldiko PCRren desabantaila nagusiak:

Sentikortasuna falta da oraindik, eta kopia gutxiko aleak hautematea ez da zehatza.

Hondoko balioaren eragina dago, eta emaitza interferentziak jasan ditzake.

Erreakzio-sisteman PCR inhibitzaileak daudenean, detekzio-emaitzak interferentziak jasan ditzakete.

Hirugarren belaunaldiko PCR digitala

PCR digitalak (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) xede-sekuentziaren kopia-zenbakia kalkulatzen du amaierako detekzio bidez, eta detekzio kuantitatibo absolutu zehatza egin dezake barne-kontrolak eta kurba estandarrak erabili gabe.

PCR digitalak amaierako detekzioa erabiltzen du eta ez dago Ct balioaren (zikloaren atalasea) araberakoa, beraz, PCR digitalaren erreakzioa anplifikazio-eraginkortasunak gutxiago eragiten du eta PCR erreakzioaren inhibitzaileekiko tolerantzia hobetzen da, zehaztasun eta erreproduzigarritasun handiarekin.

Sentikortasun handiko eta zehaztasun handiko ezaugarriak direla eta, PCR erreakzio inhibitzaileek ez dute erraz interferentziarik eragiten, eta benetako kuantifikazio absolutua lor dezake produktu estandarrik gabe, ikerketa eta aplikazio gune bihurtu dena.

Erreakzio-unitatearen forma ezberdinen arabera, hiru mota nagusitan bana daiteke: mikrofluidikoak, txipak eta tanta-sistemak.

1) PCR digital mikrofluidikoa, mdPCR:

Teknologia mikrofluidikoan oinarrituta, DNA txantiloia bereizten da.Teknologia mikrofluidikoak laginaren nano-eberritzea edo tanta txikiagoak sortzeaz gain, tantek adsortzio-metodo berezi bat behar dute eta, ondoren, PCR erreakzio-sistemarekin konbinatu.mdPCR pixkanaka-pixkanaka ordezkatzeko beste metodo batzuek hartu dute.

2) Tantatan oinarritutako PCR digitala, ddPCR:

Erabili ur-olio-tantak sortzeko teknologia lagina tantatan prozesatzeko, eta zatitu azido nukleiko molekulak dituen erreakzio-sistema milaka nano-eskalako tantatan, eta horietako bakoitzak ez dauka detektatu beharreko azido nukleikoko xede-molekula edo probatu beharreko azido nukleikoko molekula bat baino gehiago ditu.

3) Txipetan oinarritutako PCR digitala, cdPCR:

Erabili fluidoen bide-teknologia integratua mikrohodi eta mikrobarrunbe asko siliziozko obleetan edo kuartzozko beiran grabatzeko, eta disoluzioaren emaria kontrolatzeko kontrol-balbula ezberdinen bidez, eta zatitu lagin-likidoa tamaina bereko nanometroetan PCR Erreakzio digitalerako erreakzio-putzuetan kuantifikazio absolutua lortzeko.

Hirugarren belaunaldiko PCRren desabantaila nagusiak:

Ekipamendua eta erreaktiboak garestiak dira.

Txantiloiaren kalitate-eskakizunak altuak dira.Txantiloiaren kantitatea mikrosistemaren kantitatea gainditzen badu, ezinezkoa izango da kuantifikatzea, eta txikiegia bada, kuantifikazioaren zehaztasuna murriztuko da.

Anplifikazio ez-espezifikoa dagoenean ere positibo faltsuak sor daitezke.