RT-qPCR PCR teknologia arruntetik garatu da.Produktu kimiko fluoreszenteak gehitzen ditu (koloratzaile fluoreszenteak edo zunda fluoreszenteak) PCR erreakzio sistema tradizionalari, eta denbora errealean detektatzen ditu PCRren anneatze eta hedatze prozesua haien mekanismo luminiszente desberdinen arabera.Ertainaren seinale fluoreszenteen aldaketak PCRren ziklo bakoitzean produktuaren aldaketa kopurua kalkulatzeko erabiltzen dira.Gaur egun, metodo ohikoenak tindagai fluoreszenteen metodoa eta zunda metodoa dira.

Tindagai fluoreszenteen metodoa:
Tindagai fluoreszente batzuek, hala nola SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, etab., ez dute argirik igortzen berez, baina fluoreszentzia igortzen dute dsDNAren zirrikitu txikiarekin lotu ondoren.Horregatik, PCR erreakzioaren hasieran, makinak ezin du seinale fluoreszentea hauteman.Erreakzioa annealing-hedatze (bi urratseko metodoa) edo hedapen fasera (hiru urratseko metodoa) igarotzen denean, hari bikoitzak irekitzen dira une honetan, eta DNA polimerasa berria Kateen sintesian zehar, molekula fluoreszenteak dsDNA zirrikitu txikian konbinatzen dira eta fluoreszentzia igortzen dute.PCR zikloen kopurua handitu ahala, gero eta koloratzaile gehiago dsDNArekin konbinatzen dira, eta seinale fluoreszentea ere etengabe hobetzen da.Hartu SYBR Green Ⅰ adibide gisa.
Zundaketa metodoa:
Taqman zunda hidrolisi-zunda erabiliena da.Zundaren 5′ amaieran talde fluoreszente bat dago, normalean FAM.Zunda bera xede genearen sekuentzia osagarria da.Fluoroforoaren 3′ amaieran itzaltze-talde fluoreszente bat dago.Fluoreszentzia-erresonantzia-energia-transferentziaren printzipioaren arabera (Förster erresonantzia-energia transferentzia, FRET), talde fluoreszente berriemailea (molekula fluoreszente emailea) eta fluoreszente-talde itzaltzailea (molekula fluoreszente onartzailea) Kitzikapen espektroa gainjartzen denean eta distantzia oso hurbil dagoenean (7-10 nm), molekula emailearen kitzikapenak molekula emailearen autofluoreszentzia onartzen duen bitartean ahulduta dago.Beraz, PCR erreakzioaren hasieran, zunda sisteman libre eta osorik dagoenean, talde fluoreszente berriemaileak ez du fluoreszentziarik igorriko.Errekuzitzean, abiarazlea eta zunda txantiloiarekin lotzen dira.Luzapen-etapan, polimerasak etengabe sintetizatzen ditu kate berriak.DNA polimerasak 5′-3′ exonukleasa jarduera du.Zundara iristean, DNA polimerasak zunda hidrolizatuko du txantiloitik, talde fluoreszente berriemailea kencher fluoreszente taldetik bereizi eta seinale fluoreszentea askatuko du.Zundaren eta txantiloiaren artean bat-bateko erlazioa dagoenez, zunda metodoa koloratzaileen metodoa baino handiagoa da probaren zehaztasun eta sentikortasunari dagokionez.

1. irudia qRT-PCRren printzipioa

Primer diseinua
Printzipioak:

Primerak azido nukleikoen serieko eskualde kontserbatuan diseinatu behar dira eta espezifikotasuna izan.

Hobe da cDNA sekuentzia erabiltzea, eta mRNA sekuentzia ere onargarria da.Hala ez bada, aurkitu DNA sekuentziaren cds eskualdearen diseinua.
Produktu kuantitatibo fluoreszentearen luzera 80-150bp da, luzeena 300bp da, hasierako luzera, oro har, 17-25 base artekoa da, eta goranzko eta beheranzko primeren arteko aldea ez da handiegia izan behar.

G+C edukia %40 eta %60 artean dago, eta %45-55 da onena.
TM balioa 58-62 gradu artean dago.
Saiatu hasierako dimeroak eta autodimeroak saihesten (ez ager 4 base osagarri ondoz ondoko pare baino gehiago) ilearen egitura, saihestezina bada, egin ΔG<4,5kJ/mol* Alderantzizko transkripzioan gDNA kendu dela ziurtatu ezin baduzu Garbitu, hobe da introiaren abiarazpenak diseinatzea *3′ amaierako eskualde aberatsa saihesteko ezin da saihestu. 3) primerak eta ez-
espezifikoa Heterogeneoki anplifikatutako sekuentziaren homologia % 70 baino txikiagoa da edo 8 base osagarriko homologia du.
Datu-basea:
CottonFGD bilaketa gako-hitzen arabera
Lehen diseinua:
IDT-qPCR primer diseinua

Fig2 IDT lineako lehen diseinu-tresnaren orria

3. irudiaren emaitza orria bistaratzea
LncRNA abiarazleen diseinua:
lncRNA:mRNAren urrats berdinak.
miRNA:Stem-loop metodoaren printzipioa: miRNA guztiak 23 nt inguruko sekuentzia laburrak direnez, PCR zuzeneko detekzio ezin da egin, beraz, stem-loop sekuentzia tresna erabiltzen da.Zurtoin-begizta sekuentzia 50 nt inguruko DNA kate bakarrekoa da, eta berez ile-egitura bat osa dezake.3 'Amaiera miRNA zati partzialaren sekuentzia osagarri gisa diseina daiteke, eta, ondoren, xede miRNA zurtoin-begizta sekuentziara konektatu daiteke alderantzizko transkripzioan, eta luzera osoa 70bp-ra irits daiteke, qPCR-k zehaztutako produktu anplifikatuaren luzerarekin bat datorrena.Tailing miRNA primer diseinua.
Anplifikazioaren detekzio espezifikoa:
Lineako leherketaren datu-basea: CottonFGD leherketa sekuentzia antzekotasunaren arabera
Tokiko eztanda: ikusi Blast+ erabiltzea tokiko eztanda egiteko, linux eta macos-ek zuzenean tokiko datu-base bat ezar dezakete, win10 sistema ubuntu bash instalatu ondoren ere egin daiteke.Sortu tokiko eztanda datu-basea eta tokiko eztanda;ireki ubuntu bash win10-en.
Oharra: goialdeko kotoia eta itsasoko uharteko kotoia labore tetraploideak dira, beraz, eztandaren emaitza bi partida edo gehiago izango dira askotan.Iraganean, NAU cd-ak datu-base gisa erabiliz eztanda egiteko litekeena da bi gene homologo aurkitzea SNP desberdintasun gutxi batzuekin.Normalean, bi gene homologoak ezin dira lehen diseinuaren bidez bereizi, beraz, berdin tratatzen dira.Indel agerikoa bada, indelaren gainean diseinatu ohi da indel, baina honek lehen-egitura sekundarioa ekar dezake Energia askea handiagoa da, anplifikazio-eraginkortasuna gutxitzea dakar, baina hori ezinbestekoa da.

Lehen egitura sekundarioaren detekzioa:
Urratsak:ireki oligo 7 → sarrera txantiloiaren sekuentzia → itxi azpi-leihoa → gorde → kokatu primer txantiloian, sakatu ctrl+D primer luzera ezartzeko → analizatu bigarren mailako hainbat egitura, hala nola autodimerizazio-gorputza, heterodimeroa, ile-ondoa, bat-etortzea, etab.Aurrealdeko primeraren emaitza ona da, ez dago ageriko dimerorik eta ilearen egiturarik, ez dago oinarri osagarri jarraiturik, eta energia askearen balio absolutua 4,5 baino txikiagoa da, atzeko primerak etengabea erakusten duen bitartean 6 oinarri osagarriak dira eta energia askea 8,8koa da;gainera, 3′ muturrean dimero larriagoa agertzen da, eta jarraian 4 oinarriko dimero bat agertzen da.Energia librea handia ez den arren, 3′ dimero Chl-ak anplifikazioaren espezifikotasuna eta anplifikazio-eraginkortasuna larriki eragin ditzake.Horrez gain, beharrezkoa da ile-hornak, heterodimeroak eta bat ez datozenak egiaztatu behar dira.

Fig3 oligo7 detektatzeko emaitzak
Anplifikazio-eraginkortasunaren detekzioa:
PCR erreakzioaren anplifikazio-eraginkortasunak PCR emaitzei larriki eragiten die.QRT-PCR-n ere, anplifikazio-eraginkortasuna bereziki garrantzitsua da emaitza kuantitatiboetarako.Kendu beste substantzia, makinak eta protokoloak erreakzio-tapoian.Primeren kalitateak ere eragin handia du qRT-PCRren anplifikazio-eraginkortasunean.Emaitzen zehaztasuna bermatzeko, bai fluoreszentzia-kuantifikazio erlatiboak bai fluoreszentzia-kuantifikazio absolutuak abiarazteen anplifikazio-eraginkortasuna detektatu behar dute.Onartzen da qRT-PCR anplifikazio eraginkorra % 85 eta % 115 artekoa dela.Bi metodo daude:
1. Kurba estandarraren metodoa:
a.cDNA nahastu
b.Gradientearen diluzioa
c.qPCR
d.Erregresio linealaren ekuazioa anplifikazio-eraginkortasuna kalkulatzeko
2. LinRegPCR
LinRegPCR denbora errealeko RT-PCR Datuak aztertzeko programa bat da, SYBR Green edo antzeko kimikan oinarritutako PCR kuantitatiboen (qPCR) datu ere deitua.Programak oinarrizko zuzenketa ez diren datuak erabiltzen ditu, oinarrizko zuzenketa bat egiten du lagin bakoitzean Bereiz, linealtasun-leiho bat zehazten du eta, ondoren, erregresio linealaren analisia erabiltzen du PCR datu-multzoaren bidez lerro zuzen bat egokitzeko.Zuzen honen maldatik lagin bakoitzaren PCR eraginkortasuna kalkulatzen da.Anplikoi bakoitzeko PCRren batez besteko eraginkortasuna eta lagin bakoitzeko Ct balioa lagin bakoitzeko hasierako kontzentrazioa kalkulatzeko erabiltzen dira, fluoreszentzia-unitate arbitrarioetan adierazita.Datuak sarrera eta irteera Excel kalkulu orri baten bidez egiten dira.Lagin bakarra
nahasketa beharrezkoa da, gradienterik gabe
urratsak behar dira:(Hartu Bole CFX96 adibide gisa, ez oso Makina ABI argiarekin)
esperimentua:qPCR esperimentu estandarra da.
qPCR datuen irteera:LinRegPCR-k bi irteera-fitxategiak ezagutu ditzake: RDML edo kuantifikazioa Anplifikazio-emaitza.Izan ere, makinaren ziklo-zenbakiaren eta fluoreszentzia-seinalearen denbora errealeko detekzio-balioa da, eta anplifikazioa segmentu linealaren eraginkortasunaren fluoreszentzia-aldaketaren balioa aztertuz lortzen da.
Datuen hautaketa: Teorian, RDML balioak erabilgarri izan beharko luke.Uste da nire ordenagailuaren arazoa softwareak ezin duela RDML ezagutu, beraz, excel irteerako balioa daukat jatorrizko datu gisa.Lehenik eta behin datuen baheketa zakarra egitea gomendatzen da, esate baterako, laginak gehitzearen porrota, etab. Irteerako datuetan puntuak ezabatu daitezke (noski, ezin dituzu ezabatu, LinRegPCR-k puntu horiei jaramonik egingo die azken fasean)

5. irudia qPCR datuen esportazioa

6. irudia lagin hautagaien aukeraketa

Datuen sarrera:Ireki qualification amplification results.xls, → ireki LinRegPCR → fitxategia → irakurri excel-etik → hautatu parametroak 7. Irudian ikusten den moduan → Ados → egin klik zehaztu oinarri-lerroak

linRegPCR datuen sarreraren 7. irudia

Emaitza:Errepikapenik ez badago, ez da taldekatu behar.Errepikapena badago, taldekatzea lagin-multzoan edita daiteke, eta identifikatzailean genearen izena sartzen da, eta orduan gene bera automatikoki taldekatuko da.Azkenik, egin klik fitxategian, esportatu excel eta ikusi emaitzak.Putzu bakoitzaren anplifikazio-eraginkortasuna eta R2 emaitzak bistaratuko dira.Bigarrenik, taldetan banatzen bazara, zuzendutako batez besteko anplifikazio-eraginkortasuna bistaratuko da.Ziurtatu primer bakoitzaren anplifikazio-eraginkortasuna % 85 eta % 115 artekoa dela.Handiegia edo txikiegia bada, esan nahi du primeraren anplifikazio-eraginkortasuna eskasa dela.

8. irudia Emaitza eta datuen irteera

Prozesu esperimentala:
RNA kalitate baldintzak:
Garbitasuna:1.72.0-k adierazten du hondar isotiozianatoa egon daitekeela.A260/A230 azido nukleiko garbiak 2 ingurukoa izan behar du. 230 nm-an xurgapen handia badago, fenato ioiak bezalako konposatu organikoak daudela adierazten du.Gainera, %1,5eko agarosa gel elektroforesiaren bidez detektatu daiteke.Seinalatu markatzailea, ssRNAk ez duelako desnaturalizaziorik eta pisu molekularren logaritmoak ez duelako erlazio lineal bat, eta pisu molekularra ezin baita behar bezala adierazi.Kontzentrazioa: Teorikokiez100ng/ul baino gutxiago, kontzentrazioa baxuegia bada, purutasuna baxua da, oro har, ez altua

Fig9 RNA gela

Gainera, lagina preziatua bada eta RNA-kontzentrazioa handia bada, erauzi ondoren alikuota egitea gomendatzen da, eta RNA-a 100-300ng/ul-ko azken kontzentraziora diluitzea alderantzizko transkripziorako.Inalderantzizko transkripzioaren prozesua, mRNA transkribatzen denean, poliA isatsekin zehazki lotu daitezkeen oligo (dt) abiarazleak alderantzizko transkripziorako erabiltzen dira, lncRNA eta circRNA ausazko hexamer (Random 6 mer) abiarazleak RNA osoaren alderantzizko transkripziorako MiRNArako, miRNA-ren espezifikoak lepo-begizta abiarazleak alderantzizko transkripziorako erabiltzen dira.Enpresa askok gaur egun isatsen kit bereziak jarri dituzte martxan.Stem-loop metodorako, buztanen metodoa erosoagoa da, errendimendu handikoa eta erreaktiboak aurrezten dituena, baina familia bereko miRNAak bereizteko efektuak ez luke izan behar zurtoin-begizta metodoa bezain ona.Alderantzizko transkripzio-kit bakoitzak gene espezifikoen hasierako (stem-loops) kontzentratzeko baldintzak ditu.MiRNArako erabiltzen den barne erreferentzia U6 da.Zurtoin-begizta inbertitzeko prozesuan, U6-ren hodi bat alderantzikatu behar da bereizita, eta U6-ren aurrealdeko eta atzealdeko lehenak zuzenean gehitu behar dira.Bai circRNAk bai lncRNAk HKGak erabil ditzakete barne erreferentzia gisa.IncDNA detektatzea,
RNArekin arazorik ez badago, cDNAk ere ondo egon beharko luke.Hala ere, esperimentuaren perfekzioa bilatzen bada, hobe da gDNA eta cd-ak bereizteko barne erreferentziako gene bat erabiltzea (Reference gene, RG).Orokorrean, RG etxeko gene bat da., HKG) 10. Irudian ikusten den bezala;Garai hartan, soja biltegiratzeko proteina egiten ari nintzen, eta introiak zituen aktina7 erabiltzen nuen barne erreferentzia gisa.Primer honen zati anplifikatuaren tamaina gDNAn 452bp zen, eta cDNA txantiloi gisa erabiltzen bazen, 142bp zen.Ondoren, probaren emaitzek aurkitu zuten cDNAren zati bat benetan gDNAk kutsatuta zegoela, eta alderantzizko transkripzioaren emaitzarekin arazorik ez zegoela frogatu zuten, eta PCRrako txantiloi gisa erabil zitekeela.Alferrikakoa da agarosa gel elektroforesia zuzenean cDNArekin egitea, eta banda difusoa da, ez da konbentzigarria.

10. irudia cDNA detekzioa

qPCR baldintzen zehaztapenaOro har, ez da arazorik kitaren protokoloaren arabera, batez ere tm balioaren urratsean.Inprimagailu batzuk diseinatzen ez badira ondo diseinatuta, tm balioaren eta 60°C teorikoaren arteko alde handia sortzen bada, gomendatzen da cDNA Laginak nahastu ondoren, PCR gradiente bat egitea abiarazleekin, eta saiatzea TM balio gisa bandarik gabeko tenperatura ezartzea.

Datuen azterketa

Ohiko fluoreszentzia erlatiboa PCR prozesatzeko metodo kuantitatiboa, funtsean, 2-ΔΔCT.Datuak tratatzeko txantiloia.

Erlazionatutako produktuak:

Denbora errealeko PCR erraza^TM –Taqman

Denbora errealeko PCR erraza^TM –SYBR BERDEA I

RT Easy I (Master Premix lehen katearen cDNA sintesirako)

RT Easy II (Master Premix lehen katearen cDNA sintesirako qPCRrako)