Ⅰ. Handitu erreakzio-sistemaren sentikortasuna:
1. Kalitate handiko RNA bereizi:
cDNA sintesi arrakastatsua kalitate handiko RNAtik dator.Kalitate handiko RNAk gutxienez luzeagoa izan behar du eta ez du grabazio entzimarik ez duten inhibitzailerik, hala nola EDTA edo SDS.RNAren kalitateak cDNAra transkribatu dezakezun sekuentzia-informazioaren balio maximoa zehazten du.RNA arazteko metodo orokorra isoozianato/azidofenola erabiltzeko urrats metodo bat da.RNasaren kutsadura saihesteko, RNasan aberatsa den lagin batetik (pankreakoa adibidez) bereizitako RNAak formaldehidoa biltegiratzea behar du kalitate handiko RNA gordetzeko, eta hori are gehiago epe luzerako biltegiratzeko.Arratoiaren gibeletik ateratako ARNa, funtsean, astebete uretan biltegiratu ondoren degradatu zen, arratoiaren bareatik ateratako RNAa egonkor mantendu zen bitartean hiru urtez uretan gorde ondoren.Horrez gain, 4kb baino handiagoak diren transkripzioak RNasaren aztarnaren degradaziorako sentikorragoak dira transkripzio txikiak baino.Biltegiratze RNA laginaren egonkortasuna areagotzeko, RNA ioi metalmamina batean disolbatu daiteke, eta -70 °C gordetzen da.RNA gordetzeko erabiltzen den tilidoak ez du eduki behar RNA degradatzen duen objektu ezberdinik.RNA, pankreatik eratorria, metamaminan gorde daiteke gutxienez urtebetez.RNA erabiltzeko prest zaudenean, metodo hauek erabil ditzakezu RNA hauspeatzeko: gehitu NaCl 0,2 m eta 4 aldiz etanolaren bolumena, jarri giro-tenperatura 3-5 minutuz eta 10.000 × g zentrifugo 5 minutuz.
2. Erabili alderantzizko transkriptasa RNaseH jarduerarik gabe (RNaseH-):
RNasaren inhibitzaileak sarritan gehitzen dira alderantzizko transkripzio erreakzioetan cDNA sintesiaren luzera eta etekina handitzeko.RNasaren inhibitzailea lehen kate-sintesi-erreakzioan bufferen eta DTT bezalako agente murriztaileen presentzian gehitzen da, ADNaren aurreko sintesi-prozesuak inhibitzailea desnaturalizatzen duelako, eta, ondorioz, RNA degradatzen duten RNasak askatzen ditu.Protein RNasaren inhibitzaileak RNasak A, B, C-k ARNaren degradazioa soilik eragozten du, eta ez ditu larruazaleko RNasak eragozten, beraz, kontuz ibili behar da hatzetatik RNasak ez sartzeko inhibitzaile hauek erabili arren.
Alderantzizko transkriptasak RNA cDNA bihurtzea katalizatzen du.Bi M-MLV eta AMV-k RNaseH jarduera endogenoa dute polimerasaren jardueraz gain.RNasaH jarduera polimerasaren jarduerarekin lehiatzen da RNA txantiloien eta DNA-ren abiarazleen edo cDNA hedapen-kateen artean eratutako kate heterozigotikoen alde, eta RNA: RNA kateak degradatzen ditu DNA konplexuetan.RNaseH jarduerak degradatutako RNA txantiloiak ezin dira jada cDNA sintesirako substratu eraginkor gisa erabili, cDNA sintesiaren etekina eta luzera murriztuz.Beraz, alderantzizko transkriptasaren RNaseH jarduera kentzea edo asko murriztea onuragarria izango litzateke.
SuperScriptⅡ alderantzizko transkriptasak, RNaseH-ren MMLV alderantzizko transkriptasak eta thermoScript alderantzizko transkriptasak, RNaseH-ren AMV-k MMLV eta AMV baino luzera osoko cDNA gehiago eman zuten.RT-PCR sentsibilitatea sintetizatutako cDNA kantitateak eragiten du.ThermoScript AMV baino askoz sentikorragoa da.RT-PCR produktuen tamaina alderantzizko transkriptasak cDNA sintetizatzeko duen gaitasunak mugatzen du, batez ere Cdna handiagoak klonatzean.MMLV-rekin alderatuta, SuperScripⅡ nabarmen handitu zuen RT-PCR produktu luzeen etekina.RNaseH-ren alderantzizko transkriptasak ere egonkortasun termikoa areagotzen du, beraz, erreakzioa 37-42 ℃ normala baino tenperatura altuagoetan egin daiteke.Iradokitako sintesi baldintzetan, oligo(dT) abiarazleak eta 10μCi [alpha-p]dCTP erabili ziren.Lehen katearen ekoizpen osoa TCA prezipitazio metodoa erabiliz kalkulatu da.Luzera osoko cDNA tamainaz sailkatutako zerrenda kentzea eta agarosa gel alkalino batean zenbatzea erabiliz aztertu zen.
3. Alderantzizko transkripzioaren beroa kontserbatzeko tenperatura handitu:
Tenperatura handiagoak RNAren egitura sekundarioa irekitzen laguntzen du eta erreakzioaren etekina handitzen du.RNA txantiloi gehienentzat, RNA eta abiarazlea 65 °C-tan edukitzea bufferrik edo gatzik gabe eta gero izotzetan azkar hozteak egitura sekundario gehienak ezabatzen ditu eta abiarazleak lotzea ahalbidetzen du.Hala ere, txantiloi batzuek bigarren mailako egitura dute oraindik, desnaturalizazio termikoaren ondoren ere.Txantiloi zail hauen anplifikazioa ThermoScript alderantzizko transkriptasa erabiliz eta alderantzizko transkriptasa erreakzioa tenperatura altuagoetan jarriz anplifikazioa hobetzeko egin daiteke.Eutsi-tenperatura altuagoek espezifikotasuna ere areagotu dezakete, batez ere cDNA sintesia gene espezifikoen lehengaiak (GSPS) erabiliz egiten denean (ikus 3. kapitulua).GSP erabiltzen baduzu, ziurtatu hasierako Tm balioa espero den eusteko tenperaturaren berdina dela.Ez erabili oligo(dT) eta ausazko lehengaiak 60 ℃-tik gora.Ausazko lehengaiak 25 ℃-tan mantendu behar dira 10 minutuz 60 ℃-ra igo aurretik.Alderantzizko transkripzio-tenperatura altuagoak erabiltzeaz gain, espezifikotasuna hobetu daiteke RNA/ primer nahasketa 65 ℃ desnaturalizazio-tenperaturatik alderantzizko transkripzioaren euste-tenperaturara zuzenean transferituz eta aurrez berotutako 2× erreakzio-nahasketa gehituz (cDNA abiarazte termikoaren sintesia).Ikuspegi honek tenperatura baxuagoetan gertatzen den molekulen arteko base parekatzea saihesten laguntzen du.PCR tresna erabiltzeak RT-PCRrako beharrezkoak diren tenperatura etengailu ugari errazten ditu.
Bero egonkortutako polimerasak DNA polimerasa gisa jokatzen du Mg2+-ren aurrean eta RNA polimerasa Mn2+-ren aurrean.Beroari eutsi diezaioke 65 ℃-ra arte.Hala ere, PCRn Mn2+ egoteak fideltasuna murrizten du, eta horrek Tth polimerasa ez da hain egokia doitasun handiko anplifikaziorako, hala nola cDNA klonatzeko.Gainera, Tth-a ez da hain eraginkorra alderantzizko transkripzioan, eta horrek sentsibilitatea murrizten du, eta entzima bakar batek alderantzizko transkripzioa eta PCR egin dezakeenez, alderantzizko transkripziorik gabeko kontrol-erreakzioak ezin dira erabili cDNAren produktu anplifikatuak eta kutsatutako DNA genomikoarenak bereizteko.
4. Alderantzizko transkripzioa sustatzen duen gehigarria:
Lehen kate-sintesi-erreakzioari gehigarriak gehitzeak, glizerina eta DMSO barne, azido nukleikoaren kate bikoitzaren egonkortasuna murrizten du eta RNAren egitura sekundarioa askatu dezake.Gehienez %20 glizerina edo %10 DMSO gehi daiteke SuperScriptⅡ edo MMLVren jarduerari eragin gabe.AMV-k ere glizerola % 20ra arte jasan dezake jarduera murriztu gabe.SuperScriptⅡ alderantzizko transkripzio erreakzioan RT-PCRren sentsibilitatea maximizatzeko, % 10 glizerola gehi daiteke eta 45 ℃-tan isolatu.PCR-ri retrotranskripzio-erreakzio produktuaren 1/10 gehitzen bazaio, anplifikazio-erreakzioan glizerolaren kontzentrazioa % 0,4 da, eta hori ez da nahikoa PCR inhibitzeko.
5. RNaseH prozesatzea:
Sentsibilitatea hobetu daiteke PCRren aurretik cDNA sintesi erreakzioak RNaseHrekin tratatuz.Txantiloi batzuetarako, uste da cDNA sintesi-erreakzioko ARNak produktu anplifikatuak lotzea eragozten duela, eta kasu horretan RNaseH tratamenduak sentsibilitatea areagotu dezake.Orokorrean, RNaseH tratamendua behar da luze samar luzeko cDNA xede txantiloi bat anplifikatzeko, hala nola kopia baxuko eskerosi tuberosoaⅡ.Txantiloi zail honetarako, RNaseH-k SuperScriptⅡ edo AMV-k sintetizatutako cDNAk sortutako seinalea hobetu zuen.RT-PCR erreakzio gehienetarako, RNaseH tratamendua aukerakoa da, 95 ℃ isolatutako PCR desnaturalizazio urratsak normalean RNA: DNA konplexutik hidrolizatzen duelako.
6. RNA kantitate txikiak detektatzeko metodo hobetuak:
RT-PCR bereziki zaila da RNA kantitate txikiak soilik daudenean.RNA bereizketan glukogenoa eramaile gisa gehitzeak lagin txikien etekina handitzen laguntzen du.RNasarik gabeko glukogeno bat gehi daiteke Trizolarekin batera.Glikogenoa uretan disolbagarria da eta RNArekin ur-fasean gera daiteke ondorengo prezipitazioan laguntzeko.RNasarik gabeko glukogenoaren kontzentrazio gomendatua 250μg/ml da ehun edo 106 zelula hazitako 50 mg baino gutxiagoko laginetarako.
SuperScriptⅡ erabiliz transkripzio-erreakzioei alderantzizko transkripzio-erreakzioei BSA azetilatua gehitzeak sentsibilitatea areagotu dezake, eta RNA kantitate txikietan, SuperScriptⅡ kopurua murriztea eta RnaseOut nukleasa inhibitzailearen 40 unitate gehitzea detekzio maila hobetu daiteke.RNA bereizketan glukogenoa erabiltzen bada, SuperScriptⅡ erabiliz transkripzio-erreakzioak alderantzikatzeko BSA edo RNasa inhibitzaileak gehitzea gomendatzen da oraindik.
Ⅱ. RT-PCRren espezifikotasuna handitzea
1. cNDA sintesia:
Hiru metodo desberdin erabil daitezke lehen katearen cDNA sintesia hasteko, eta metodo bakoitzaren espezifikotasun erlatiboak sintetizatutako cDNA kantitateari eta motari eragiten dio.
Ausazko lehen metodoa hiru metodoetatik espezifikoena da.Lehenak transkripzioan zehar hainbat gunetan erretzen dira cDNA labur eta luzera partzialean sortzeko.Metodo hau sarritan erabiltzen da 5′ terminaleko sekuentziak eta cDNA lortzeko bigarren mailako egitura-eskualdeak dituzten RNA txantiloiak edo alderantzizko transkriptasa erreplikatu ezin duten amaiera-guneak dituztenak.cDNA luzeena lortzeko, ARN lagin bakoitzeko abiarazleen eta ARNaren arteko erlazioa enpirikoki zehaztu behar da.Ausazko primeren hasierako kontzentrazioa 50 eta 250ng bitartekoa da 20μl erreakzio-sistema bakoitzeko.Ausazko abiarazleak erabiliz ARN osotik sintetizatutako cDNA batez ere RNA erribosomikoa denez, poli(A)+RNA aukeratzen da orokorrean txantiloi gisa.
Oligo(dT) hasiera espezifikoagoa da ausazko primerak baino.Zelula eukarioto gehienetan mRNAren 3′ amaieran aurkitzen den poli(A) isatsarekin hibridatzen da.Poli(A)+RNA RNA osoaren %1etik %2ra gutxi gorabehera, cDNAren kantitatea eta konplexutasuna askoz ere txikiagoa da ausazko lehengaiak erabiliko balira baino.Bere espezifikotasun handia dela eta, oligo(dT) orokorrean ez du optimizaziorik behar RNA eta primer erlaziorako eta poli(A)+ hautapenerako.20μl erreakzio sistema bakoitzeko 0,5μg oligo(dT) erabiltzea gomendatzen da.oligo(dT)12-18 egokia da RT-PCR gehienetarako.ThermoScript RT-PCR Sistemak oligo(dT)20 eskaintzen du bere egonkortasun termiko ona dela eta eta eusteko tenperatura altuagoetarako egokia da.
Gene-specific primers (GSP) alderantzizko transkripzio urratserako abiarazle espezifiko onenak dira.GSP zentzuaren aurkako oligonukleosido bat da, RNA helmuga-sekuentziekin bereziki hibridatu daitekeena, Rna guztiak ausazko abiarazle edo oligo(dT) bezala errekuzitu beharrean.PCR abiarazleak diseinatzeko erabiltzen diren arauak alderantzizko transkripzio erreakzioaren GSP diseinuan ere aplikatzen dira.GSP mRNA3'-ren amaieran anplifikazio-hastapenaren sekuentzia bera izan daiteke, edo GSP alderantzizko anplifikazio-hastapenarekin uretan beheran anneatzeko diseinatu daiteke.Anplifikatutako objektu batzuentzat, beharrezkoa da zentzuaren aurkako abiarazlea bat baino gehiago diseinatzea RT-PCR arrakastatsurako, xede RNAren egitura sekundarioak abiarazlea lotzea eragotzi dezakeelako.20μl-ko lehen kate-sintesi erreakzio-sisteman 1pmol antisenso GSP erabiltzea iradokitzen da.
2. Alderantzizko transkripzioaren beroa kontserbatzeko tenperatura handitu:
GSP espezifikotasunari ahalik eta etekin handiena ateratzeko, egonkortasun termiko handiko alderantzizko transkriptasa erabili behar da.Beroan egonkorra den alderantzizko transkriptasa tenperatura altuagoetan isolatu daiteke erreakzioaren zorroztasuna areagotzeko.Esate baterako, GSP bat 55 °C-tan erretzen bada, GSPren espezifikotasuna ez da guztiz erabiltzen alderantzizko transkripzioa 37 °C-tan egiten bada zorroztasun txikiarekin AMV edo M-MLV erabiliz.Hala ere, SuperScripⅡ eta ThermoScript-ek 50 ℃ edo handiagoan erreakziona dezakete, eta horrek tenperatura baxuagoetan ekoitzitako produktu ez-espezifikoak ezabatzen ditu.Gehieneko espezifikotasuna lortzeko, RNA/ primer nahasketa zuzenean transferi daiteke 65 ℃ desnaturalizazio-tenperaturatik alderantzizko transkripzioaren euste-tenperaturara, aurrez berotutako 2 x erreakzio-nahasketa gehituta (cDNA-ren sintesiaren hasiera termikoa).Horrek tenperatura baxuetan molekulen arteko base parekatzea saihesten du.PCR tresna erabiltzeak RT-PCRrako beharrezkoak diren tenperatura-trantsizio ugari errazten ditu.
3. ADN genomikoaren kutsadura murriztea:
RT-PCRren zailtasun potentzial bat RNAk DNA genomikoa kutsatzen duela da.RNA bereizteko metodo hobeak erabiltzeak, Trizol Erreaktiboa adibidez, DNA genomikoaren kutsadura murrizten du RNA prestakinetan.DNA genomikotik ekoitzitako produktuak ekiditeko, RNA anplifikazio-mailako DnasⅠrekin trata daiteke, kutsatutako DNA kentzeko alderantzizko transkripzioa egin aurretik.Laginak 65 ℃-tan mantendu ziren 2,0 mM EDTAn 10 minutuz DNaseⅠ digestioa amaitzeko.EDTAk magnesio ioiak kelatzen ditu tenperatura altuetan gertatzen den magnesio ioien menpeko RNA hidrolisia saihesteko.
Anplifikatutako cDNA genomaren DNA anplifikatzeko produktutik bereizteko, bereizitako exoiarekin bereizten diren lehengaiak diseinatu daitezke.cDNAtik eratorritako PCR produktuak kutsatutako DNA genomikotik eratorritakoak baino laburragoak izango dira.Alderantzizko transkripziorik gabeko esperimentu kontrolatu bat ere egiten da RNA txantiloi bakoitzean, zati jakin bat DNA genomikokoa edo cDNAkoa den zehazteko.Alderantzizko transkripziorik ezean lortutako PCR produktuak genomatik eratortzen dira.
Lotutako produktua
-Urrats bakarreko kitari esker, alderantzizko transkripzioa eta PCR hodi berean egin daitezke.Txantiloi RNA, PCR abiarazle espezifikoak eta RNasarik gabeko ddH bakarrik gehitu behar ditu2O.
-RNAren denbora errealeko analisi kuantitatiboa azkar eta zehaztasunez egin daiteke.
-Kitak Foregene alderantzizko transkripzio erreaktibo berezia eta Foregene HotStar Taq DNA Polimerasa erabiltzen ditu erreakzio-sistema berezi batekin konbinatuta, erreakzioaren anplifikazio-efizientzia eta espezifikotasuna eraginkortasunez hobetzeko.
-Erreakzio-sistema optimizatuak erreakzioak detekzio-sentsibilitate handiagoa, egonkortasun termiko sendoagoa eta tolerantzia hobea izatea eragiten du.
-gDNA kentzeko gaitasun eraginkorra, txantiloian gDNA kendu dezakeena 2 minuturen buruan.
- Alderantzizko transkripzio-sistema eraginkorra, 15 minutu baino ez ditu behar lehen katearen cDNAren sintesia burutzeko.
-Txantiloi konplexuak: GC eduki handia eta egitura sekundario konplexua duten txantiloiak ere eraginkortasun handiz alderantzikatu daitezke.
-Sentikortasun handiko alderantzizko transkripzio-sistema, pg-mailako txantiloiak kalitate handiko cDNA ere lor dezakete.
- Alderantzizko transkripzio sistemak egonkortasun termiko handia du, erreakzio-tenperatura optimoa 42 ℃ da, eta alderantzizko transkripzio errendimendu ona du oraindik 50 ℃-tan.
Argitalpenaren ordua: 2023-07-07
