1. Oinarrizko ezagutzak (zati esperimentala ikusi nahi baduzu, mesedez zuzenean bigarren zatira pasatu)
PCR konbentzionalen erreakzio deribatu gisa, denbora errealeko PCR-k batez ere PCR anplifikazio-erreakzioaren ziklo bakoitzean anplifikazio produktuaren aldaketa kontrolatzen du denbora errealean fluoreszentzia seinalearen aldaketaren bidez, eta hasierako txantiloia kuantitatiboki aztertzen du ct balioaren eta kurba estandarraren arteko erlazioaren bidez.
RT-PCRren datu zehatzak hauek diraoinarri-lerroa, fluoreszentzia atalaseaetaCt balioa.
| oinarri-lerroa: | 3.-15. zikloko fluoreszentzia-balioa oinarri-lerroa (oinarrizko lerroa) da, neurketaren noizbehinkako akatsak eragindakoa. |
| Atalasea (atalasea): | Anplifikazio-kurbaren hazkunde esponentzialeko eskualdean posizio egoki batean ezarritako fluoreszentzia detektatzeko mugari egiten dio erreferentzia, oro har, oinarri-lerroaren desbideratze estandarra baino 10 aldiz handiagoa da. |
| CT balioa: | Erreakzio-hodi bakoitzeko fluoreszentzia-balioa atalaseera iristen denean PCR ziklo kopurua da. Ct balioa hasierako txantiloiaren zenbatekoaren alderantziz proportzionala da. |
RT-PCRrako etiketatze metodo arruntak:
| metodoa | abantaila | gabezia | aplikazio-esparrua |
| SYBR BerdeaⅠ | Aplikazio zabala, sentikorra, merkea eta erosoa | Primer-eskakizunak handiak dira, banda ez-espezifikoak izateko joera | Xede-gene ezberdinen analisi kuantitatiborako egokia da, gene-adierazpenari buruzko ikerketarako eta animalia eta landare transgeniko birkonbinatzaileen ikerketarako. |
| TaqMan | Espezifikotasun ona eta errepikakortasun handia | Prezioa altua da eta helburu zehatzetarako soilik egokia da. | Patogenoen detekzioa, botiken erresistentzia geneen ikerketa, sendagaien eraginkortasunaren ebaluazioa, gaixotasun genetikoen diagnostikoa. |
| baliza molekularra | Espezifikotasun handia, fluoreszentzia, hondo baxua | Prezioa altua da, helburu zehatz baterako bakarrik egokia da, diseinua zaila da eta prezioa altua da. | Gene-analisi espezifikoa, SNP analisia |
2. Urrats esperimentalak
2.1 Talde esperimentalari buruz- Taldean putzu anitz egon behar dira, eta errepikapen biologikoak egon behar dira.
| ① | Kontrol hutsa | Esperimentuetan zelularen hazkuntza-egoera detektatzeko erabiltzen da |
| ② | Kontrol negatiboa siRNA (siRNA sekuentzia ez-espezifikoa) | RNAi ekintzaren espezifikotasuna frogatzea.siRNA-k estres erantzun ez-espezifikoa eragin dezake 200 nM-ko kontzentrazioan. |
| ③ | Transfekzio erreaktiboen kontrola | Baztertu transfekzio-erreaktiboak zeluletarako duen toxikotasuna edo xede-genearen adierazpenean duen eragina. |
| ④ | siRNA xede genearen aurka | Eraman ezazu xede genearen adierazpena |
| ⑤ (aukerakoa) | siRNA positiboa | Sistema esperimentalak eta funtzionamendu arazoak konpontzeko erabiltzen da |
| ⑥ (aukerakoa) | Kontrol fluoreszentearen siRNA | Zelula transfekzioaren eraginkortasuna mikroskopioarekin ikus daiteke |
2.2 Primer diseinuaren printzipioak
| Anplifikatutako zatiaren tamaina | Hobe 100-150bp-n |
| Primer Luzera | 18-25bp |
| GC edukia | %30-%70, ahal izanez gero, %45-55 |
| Tm balioa | 58-60 ℃ |
| Sekuentzia | Saihestu T/C etengabea;A/G etengabea |
| 3 amaierako sekuentzia | Saihestu GC aberatsa edo AT aberatsa;terminal-oinarria hobe da G edo C;hobe da T saihestea |
| Osagarritasuna | Saihestu 3 base baino gehiagoko sekuentzia osagarriak abiarazlearen barruan edo bi abiarazteren artean |
| Espezifikotasuna | Erabili leherketa bilaketa primer espezifikotasuna berresteko |
①SiRNA espeziearen espezifikoa da, eta espezie ezberdinen sekuentziak desberdinak izango dira.
②SiRNA hauts liofilizatuan ontziratzen da, giro-tenperaturan 2-4 astez egonkor gorde daitekeena.
2.3 Aldez aurretik prestatu behar diren tresnak edo erreaktiboak
| Primera (barne erreferentzia) | Aurrera eta atzerako bi barne |
| Primerak (helburuko genea) | Aurrera eta atzerako bi barne |
| Helburuko Si RNA (3 zerrenda) | Orokorrean, konpainiak 3 zerrenda sintetizatuko ditu, eta, ondoren, hiruretatik bat aukeratuko du RT-PCR bidez |
| Transfekzio Kit | Lipo2000 etab. |
| RNA erauzketa azkarreko kit | Transfekzioaren ondoren RNA erauzteko |
| Alderantzizko transkripziorako kit azkarra | cDNA sintesirako |
| PCR Anplifikazio Kit | 2×Super SYBR Berdea qPCR Master Mix |
2.4 Pauso esperimental zehatzetan arreta jarri behar diren gaiei dagokienez:
①siRNA transfekzio prozesua
1. Plaka egiteko, 24 putzuko plaka, 12 putzuko plaka edo 6 hobiko plaka aukeratu dezakezu (24 putzuko plaka baten putzu bakoitzean proposatzen den batez besteko RNA kontzentrazioa 100-300 ng/uL ingurukoa da), eta zelulen transfekzio-dentsitate optimoa % 60 -% 80 edo gehienez.
2. Transfekzio-urratsak eta eskakizun espezifikoak argibideen araberakoak dira.
3. Transfekzioaren ondoren, laginak 24-72 ordutan jaso daitezke mRNA detektatzeko (RT-PCR) edo proteinak detektatzeko 48-96 orduko epean (WB)
② RNA erauzteko prozesua
1. Entzima exogenoek kutsatzea saihestea.Batez ere, maskarak eta eskularruak zorrozki eramatea barne hartzen du;pipeta punta esterilizatuak eta EP hodiak erabiliz;esperimentuan erabilitako urak RNasik gabekoa izan behar du.
2. Erauzketa azkarreko kitan iradokitako bi aldiz egitea gomendatzen da, garbitasuna eta etekina benetan hobetuko dituena.
3. Hondakin-likidoak ez du RNA zutabea ukitu behar.
③ RNAren kuantifikazioa
RNA atera ondoren, zuzenean kuantifikatu daiteke Nanodroparekin, eta gutxieneko irakurketa 10ng/ul-koa izan daiteke.
④ Alderantzizko transkripzio prozesua
1. RT-qPCRren sentsibilitate handia dela eta, gutxienez 3 putzu paralelo egin behar dira lagin bakoitzeko, ondorengo Ct desberdinegia edo SD handiegia izan ez dadin analisi estatistikorako.
2. Ez izoztu eta desizoztu Master Mix behin eta berriz.
3. Hodi/zulo bakoitza punta berri batekin ordezkatu behar da!Ez erabili pipeta-punta bera etengabe laginak gehitzeko!
4. Lagina gehitu ondoren 96 putzuko plakari atxikitako filma plaka batekin leundu behar da.Hobe da makinan jarri baino lehen zentrifugatzea, hodiaren horman likidoa jaisten eta aire-burbuilak kentzeko.
⑤Kurba arruntaren azterketa
| Hazkunde logaritmikoko aldirik ez | Baliteke txantiloiaren kontzentrazio handia |
| CT baliorik ez | Seinale fluoreszenteak detektatzeko urrats okerrak; abiarazteen edo zunden degradazioa - bere osotasuna PAGE elektroforesiaren bidez detekta daiteke; txantiloi kopuru nahikoa; Txantiloien degradazioa - ezpurutasunak eta laginak prestatzerakoan behin eta berriz izoztea eta desizoztea saihestea; |
| Ct>38 | Anplifikazio-eraginkortasun baxua;PCR produktua luzeegia da;hainbat erreakzio-osagai degradatzen dira |
| Anplifikazio-kurba lineala | Izozte-desizozte-ziklo errepikatuek edo argiarekiko esposizio luzez zundak partzialki degradatu daitezke |
| Zulo bikoiztuen aldea bereziki handia da | Erreakzio-disoluzioa ez da guztiz urtzen edo erreakzio-disoluzioa ez da nahasten;PCR tresnaren bainu termikoa substantzia fluoreszenteek kutsatuta dago |
2.5 Datuen analisiari buruz
qPCRren datuen analisia kuantifikazio erlatiboan eta kuantifikazio absolutuetan bana daiteke.Adibidez, tratamendu taldeko zelulak kontrol taldeko zelulekin alderatuta,
X genearen mRNA zenbat aldiz aldatzen den, hau kuantifikazio erlatiboa da;zelula kopuru jakin batean, X genearen mRNA
Zenbat kopia dauden, hau kuantifikazio absolutua da.Normalean laborategian gehien erabiltzen duguna metodo kuantitatibo erlatiboa da.Normalean,2-ΔΔct metodoaesperimentuetan erabiltzen da gehien, beraz, metodo hau bakarrik sartuko da xehetasunez hemen.
2-ΔΔct metodoa: Lortutako emaitza talde esperimentalean xede-genearen adierazpenaren aldea da kontrol-taldeko xede-genarekiko.Xede-genearen zein barne-erreferentzia-genearen anplifikazio-eraginkortasunak % 100etik gertu egotea beharrezkoa da, eta desbideratze erlatiboa ez da % 5etik gorakoa izan behar.
Kalkulatzeko metodoa honako hau da:
Δct kontrol-taldea = xede-genearen ct balioa kontrol-taldean - ct balioa kontrol-taldean barneko erreferentzia-genearen balioa
Δct talde esperimentala = talde esperimentaleko xede-genearen ct balioa - talde esperimentaleko barne erreferentziako genearen ct balioa
ΔΔct=Δct talde esperimentala-Δct kontrol taldea
Azkenik, kalkulatu adierazpen-mailaren diferentziaren multiploa:
Aldatu Fold=2-ΔΔct (excel funtzioari dagokion POWER da)
Erlazionatutako produktuak:
Argitalpenaren ordua: 2023-05-20
