• PCR DNA txantiloi txiki batetik DNA anplifikatzeko erabiltzen den metodo bat da.RT-PCR-k alderantzizko transkripzioa erabiltzen du RNA-iturri batetik DNA txantiloia sortzeko, gero anplifikatu ahal izateko.
• PCR eta RT-PCR amaierako erreakzioak dira normalean, eta qPCR eta RT-qPCR-k, berriz, PCR erreakzioan produktuaren sintesi-tasaren zinetika erabiltzen dute txantiloi kopurua kuantitatzeko.
• Metodo berriek, PCR digitalak adibidez, hasierako DNA txantiloiaren kuantifikazio absolutua ematen dute, eta PCR isotermikoa bezalako metodoek emaitza fidagarriak emateko ekipo garestien beharra murrizten dute.

Polimerasaren kate-erreakzioa (PCR) biologia molekularreko teknika nahiko sinplea eta oso erabilia da DNA eta RNA sekuentziak anplifikatzeko eta detektatzeko.DNA klonatzeko eta anplifikatzeko metodo tradizionalekin alderatuta, askotan egunak iraun ditzaketenak, PCR-k ordu batzuk baino ez ditu behar.PCR oso sentikorra da eta gutxieneko txantiloia behar du sekuentzia zehatzak detektatzeko eta anplifikatzeko.Oinarrizko PCR metodoak gehiago aurreratu dira DNA eta RNA detektatzeko soiletik.Jarraian, PCR metodo desberdinen eta Enzo Life Sciences-en eskaintzen ditugun erreaktiboen ikuspegi orokorra eman dugu zure ikerketa-beharretarako.Zientzialariei PCR erreaktiboak azkar sartzen laguntzea dugu helburu, hurrengo ikerketa-proiektuan erabiltzeko!

PCR

PCR estandarra egiteko, behar duzun guztia DNA polimerasa, magnesioa, nukleotidoak, abiarazleak, anplifikatu beharreko DNA txantiloia eta termoziklatu bat dira.PCR mekanismoa bere helburua bezain sinplea da: 1) kate bikoitzeko DNA (dsDNA) bero desnaturalizatu egiten da, 2) abiarazleak DNA kate bakarrera lerrokatzen dira eta 3) abiarazleak DNA polimerasaren bidez hedatzen dira, ondorioz, bi kopia sortzen dira. jatorrizko DNA katea.Tenperatura eta denbora batzuetako desnaturalizazio-, anneatze- eta luzatze-prozesua anplifikazio-ziklo gisa ezagutzen da (1. irudia).

Zikloko urrats bakoitza erabilitako txantiloi eta primer multzorako optimizatu behar da.Ziklo hau gutxi gorabehera 20-40 aldiz errepikatzen da, eta gero anplifikatutako produktua azter daiteke, normalean agarosa gelaren bidez (2. irudia).

PCR metodo oso sentikorra denez eta erreakzio bakarrerako oso bolumen txikiak behar direnez, hainbat erreakziotarako nahasketa nagusi bat prestatzea gomendatzen da.Nahasketa nagusia ondo nahastu behar da eta, ondoren, erreakzio kopuruaren arabera zatitu behar da, erreakzio bakoitzak entzima, dNTP eta abiarazle kopuru bera izango duela ziurtatuz.Hornitzaile askok, hala nola, Enzo Life Sciences-ek, lehenak eta DNA txantiloia izan ezik dena duten PCR nahasketak ere eskaintzen dituzte.

Guanina/Zitosina aberatsak (GC-aberatsak) eskualdeek erronka bat suposatzen dute PCR teknika estandarretan.GC-n aberatsak diren sekuentziak egonkorragoak dira GC eduki txikiagoa duten sekuentziak baino.Gainera, GC-n aberatsak diren sekuentziak egitura sekundarioak eratzeko joera dute, hala nola ilearen begiztak.Ondorioz, GC-n aberatsak diren kate bikoitzak zailak dira guztiz bereizten desnaturalizazio fasean.Ondorioz, DNA polimerasak ezin du kate berria sintetizatu oztoporik gabe.Desnaturalizazio-tenperatura handiagoak hori hobetu dezake, eta egokitze-tenperatura eta errekostatzeko denbora laburragorako doikuntzak GC-n aberatsak diren abiarazleen lotura ez-espezifikoa ekidin dezake.Erreaktibo gehigarriek GC-n aberatsak diren sekuentzien anplifikazioa hobetu dezakete.DMSO, glizerol eta betainek GC elkarrekintzak eragiten dituzten egitura sekundarioak hausten laguntzen dute eta, ondorioz, kate bikoitzen bereizketa errazten dute.

Hot Start PCR

Anplifikazio espezifikoa PCRn gerta daitekeen arazo bat da.PCRrako erabiltzen diren DNA polimerasa gehienek ondoen funtzionatzen dute 68 °C eta 72 °C inguruko tenperaturetan.Entzima, ordea, tenperatura baxuagoetan ere aktibo egon daiteke, maila baxuagoan bada ere.Annealing-tenperaturatik oso azpitik dauden tenperaturetan, abiarazleak modu ez-espezifikoan lotu daitezke eta anplifikazio ez-espezifikoa ekar dezakete, erreakzioa izotzean ezarri arren.Hori saihestu daiteke DNA polimerasatik bereizten diren polimerasaren inhibitzaileak erabiliz tenperatura jakin batera iristen denean, horregatik hot start PCR terminoa.Inhibitzailea polimerasa lotzen duen antigorputza izan daiteke eta hasierako desnaturalizazio-tenperaturan (95 °C normalean) desnaturalizatzen du.

Fideltasun handiko polimerasa

DNA polimerasak jatorrizko txantiloi-sekuentziarekin nahiko zehatz handitzen diren arren, akatsak gerta daitezke nukleotidoen parekatzean.Klonazioa bezalako aplikazioetan desegokitzeak transkripzioak moztuak sor ditzakete, eta proteina gaizki itzuliak edo inaktiboak beheranzkoak.Bat-etortze horiek saihesteko, "zuzenketa" jarduera duten polimerasak identifikatu eta lan-fluxuan sartu dira.Lehen zuzenketa polimerasa, Pfu, 1991n identifikatu zen Pyrococcus furiosus-en.Pfu entzima honek 3' eta 5' arteko exonukleasa jarduera du.DNA anplifikatzen den heinean, exonukleasak katearen 3' muturrean ez datozen nukleotidoak kentzen ditu.Ondoren, nukleotido zuzena ordezkatzen da, eta DNAren sintesia jarraitzen du.Nukleotido-sekuentzia okerrak identifikatzea entzimarekin nukleosido trifosfato zuzenarekiko lotura-afinitatean oinarritzen da, non lotura eraginkorrak sintesia moteldu eta ordezkapen zuzena ahalbidetzen baitu.Pfu polimerasaren zuzenketa-jarduerak akats gutxiago eragiten ditu azken sekuentzian Taq DNA polimerasarekin alderatuta.Azken urteotan, beste zuzenketa-entzima batzuk identifikatu dira, eta jatorrizko Pfu entzimaren aldaketak egin dira DNA anplifikatzean errore-tasa gehiago murrizteko.

RT-PCR

Alderantzizko transkripzioa PCR edo RT-PCR, RNA txantiloi gisa erabiltzeko aukera ematen du.Urrats gehigarri batek RNA detektatzeko eta anplifikatzeko aukera ematen du.RNA alderantziz transkribatzen da DNA osagarrian (cDNA), alderantzizko transkriptasa erabiliz.RNA txantiloiaren kalitatea eta garbitasuna ezinbestekoak dira RT-PCRren arrakastarako.RT-PCRaren lehen urratsa DNA/RNA hibrido baten sintesia da.Alderantzizko transkriptasak ere RNasa H funtzioa du, hibridoaren RNA zatia degradatzen duena.Ondoren, kate bakarreko DNA molekula alderantzizko transkriptasaren DNA polimerasaren jardueraren bidez osatzen da cDNA-n.Lehen katearen erreakzioaren eraginkortasunak anplifikazio prozesuan eragina izan dezake.Hemendik aurrera, PCR prozedura estandarra erabiltzen da cDNA anplifikatzeko.RT-PCR bidez RNA cDNA bihurtzeko aukerak abantaila asko ditu, eta batez ere gene-espresioa aztertzeko erabiltzen da.RNA kate bakarrekoa da eta oso ezegonkorra da, eta horrek lan egitea zaila da.Normalean qPCR-en lehen urrats gisa balio du, RNA transkripzioak lagin biologiko batean kuantifikatzen dituena.

qPCR eta RT-qPCR

PCR kuantitatiboa (qPCR) aplikazio ugaritarako azido nukleikoak detektatzeko, karakterizatzeko eta kuantifikatzeko erabiltzen da.RT-qPCR-n, RNA transkripzioak sarritan kuantifikatzen dira alderantzizko transkripzioan cDNAn lehenik, goian azaldu bezala, eta gero qPCR egiten da.PCR estandarrean bezala, DNA errepikatzen den hiru urratsen bidez anplifikatzen da: desnaturalizazioa, annealing eta luzapena.Hala ere, qPCR-n, etiketa fluoreszenteak PCRk aurrera egin ahala datuak biltzea ahalbidetzen du.Teknika honek onura asko ditu eskuragarri dauden metodo eta kimika sorta dela eta.

Tindagaietan oinarritutako qPCR-n (normalean berdea), etiketa fluoreszenteak DNA anplifikatutako molekulen kuantifikazioa ahalbidetzen du, dsDNA lotze-koloratzaile baten bidez.Ziklo bakoitzean, fluoreszentzia neurtzen da.Fluoreszentzia-seinalea proportzionalki handitzen da erreplikatutako DNA kantitatearen arabera.Horregatik, DNA "denbora errealean" kuantifikatzen da (3. irudia).Tindagaietan oinarritutako qPCRren desabantailak dira aldi berean helburu bakarra azter daitekeela eta koloratzailea laginean dagoen edozein ds-DNArekin lotuko dela.

Zundan oinarritutako qPCR-n, helburu asko detektatu daitezke aldi berean lagin bakoitzean, baina horretarako abiarazteez gain erabilitako helburu espezifikoko zunda baten optimizazioa eta diseinua behar da.Hainbat zunda-diseinu mota daude eskuragarri, baina mota ohikoena hidrolisi-zunda bat da, fluoroforoa eta itzaltzailea barne hartzen dituena.Fluoreszentzia erresonantzia-energia transferentzia (FRET) kencher bidez fluoroforoa igortzea eragozten du zunda osorik dagoen bitartean.Hala ere, PCR erreakzioan zehar, zunda hidrolizatzen da lotzen den sekuentzia espezifikoaren luzapenean eta anplifikazioan.Zundaren zatiketak fluoroforoa kenchertik bereizten du eta anplifikazioaren menpeko fluoreszentzia handitzea eragiten du (4. irudia).Beraz, zundan oinarritutako qPCR erreakzio baten fluoreszentzia-seinalea laginean dagoen zunda helburu-sekuentziaren zenbatekoarekin proportzionala da.Zundan oinarritutako qPCR koloratzaileetan oinarritutako qPCR baino espezifikoagoa denez, askotan qPCRn oinarritutako diagnostiko-saioetan erabiltzen den teknologia da.

Anplifikazio isotermikoa

Goian aipatutako PCR teknikak termoziklatze ekipamendu garestiak behar ditu ganberaren tenperaturak gora eta behera zehaztasunez igotzeko, desnaturalizazio, anneatze eta luzapen urratsetarako.Hain gailu zehatzak behar ez dituzten hainbat teknika garatu dira eta bainu ur soil batean edo baita intereseko zelulen barruan ere egin daitezkeenak.Teknika horiei kolektiboki anplifikazio isotermikoa deitzen zaie eta anplifikazio esponentzialean, linealean edo kaskadakoan oinarritutako lan egiten dute.

Anplifikazio isotermiko mota ezagunena begizta bidezko anplifikazio isotermikoa edo LAMP da.LAMP-ek anplifikazio esponentziala erabiltzen du 65⁰C-tan, DNA edo RNA txantiloia anplifikatzeko.LAMPa egitean, xede-DNAren eskualdeen osagarri diren lau-sei abiarazte DNA polimerasa batekin erabiltzen dira DNA berria sintetizatzeko.Abiarazle horietako bik beste abiarazleetan sekuentziak ezagutzen eta lotzen dituzten sekuentzia osagarriak dituzte, eta sintetizatu berri den DNAn "begizta" egitura bat sortzeko aukera ematen du, gero abiarazteen anplifikazio-txandetan laguntzen duena.LAMPA hainbat metodoren bidez ikus daiteke, fluoreszentzia, agarosa gel elektroforesia edo kolorimetria barne.Kolorimetriaren bidez produktuaren presentzia edo eza ikusteko eta detektatzeko erraztasunak eta beharrezko ekipamendu garestirik ezak SARS-CoV-2 probak egiteko aukera egokia bihurtu zuten LAMP laborategiko proba klinikoak erraz erabilgarri ez ziren eremuetan, edo laginak biltegiratzeko eta garraiatzeko. ez zen bideragarria, edo aurretik PCR termoziklatzeko ekipamendurik ez zuten laborategietan.