RNase hitz sentikorra da, maiz RNA erauzteko esperimentuak egiten dituzten ikasle askok entzun nahi ez dutena.Erabat armatuta, azkenean fenol eta kloroformo erreaktibo oso toxikoekin ateratako RNA degradatu egin zen.Ez nago adiskidetu!!!Gaur, ikus dezagun Rnase famatuaren jatorriari.

Erribonukleasa (RNase), edo RNasa, RNA molekula txikietan hidroliza dezakeen nukleasa da.RNasa, molekula txikiko proteina gisa, ezohiko egonkorra da .Tenperatura altuko eta presio handiko lurrunaren esterilizazioa eta proteina inhibitzaileek ezin dute erabat desaktibatu.RNasaren egonkortasuna egiturako disulfuro loturetatik dator batez ere.Adibidez, behi pankreako RNasak 124 aminoazido baino ez ditu, baina 4 disulfuro lotura ditu.Sufre-loturak eta disulfuro-loturak RNasari egonkortasun termiko bikaina ematen diote.Gainera, rnasak pisu molekular nahiko txikia du eta bere jatorrizko konformazioa azkar berreskura dezake kasu askotan.

Oso egonkorra izateaz gain,RNasak nonahi daude laborategian .RNase defentsa-mekanismo biologiko bat da.Zelula batentzat, RNA exogenoa hilgarria da askotan.DNA exogenoarekin alderatuta, RNA exogenoa arriskutsuagoa da askotan.RNA zorionez transkribatzen eta itzultzen da, beraz, ia organismo guztiek RNasak eboluzionatu dituzte RNA exogenoaren inbasioaren aurka defendatzeko.Hori dela eta, laborategian lantzen diren bakterio-zelulek eta RNA ateratzen duzuen zuek RNasaren usaina darioten.Giza gorputzeko fluidoek (listua, malkoak, etab.) RNasa kopuru handia dute, beraz, ez egin negarrik RNA degradatzen denean.Zenbat eta negar gehiago egin, orduan eta okerragoa da RNA degradazioa!!Sister Daiyu ez da egokia RNA erauzteko!

Gainera, zure azal delikatuak RNasa ere badu, eta larruazalak ukitu dituen errotulagailuek, pipetak, hozkailuko ateek eta ateen heldulekuek RNasa ere badute.

Hainbeste gorabeherarekin, ikus dezagun RNasekin nola aurre egin.

RNA kentzean denek pentsatzen duten lehenengo gauza daDEPC(dietil pirokarbonatoa).DEPC-k batez ere proteina desnaturalizatzen du RNasa histidina talde aktiboaren imidazol eraztunarekin konbinatuz, eta horrela entzimaren jarduera inhibitzen du.% 0,1 DEPC-k kentzeko efektu hobea izan dezake Rnasan, baina arreta jarri behar dugu DEPC kartzinogeno ezaguna dela, beraz, arreta berezia jarri behar da erabiltzean.

RNaserako, bi alderdietatik abiatu behar dugu,lehenengoa RNasa endogenoaren jarduera inhibitzea da

Trizol-en dauden RNA-a erauzteko ohiko erreaktiboek, hala nola, guanidina isotiozianatoa eta DTTa, RNasaren disulfuro-lotura ireki dezakete, baina oraindik RNasa batzuk daude, batez ere ehun-laginetan, beraz, arreta jarri tenperatura baxuari.

1.Berehala murgildu ehun-lagina nitrogeno likidoan atera ondoren, edo RNA kontserbatzeko soluzio komertzialean.

2.Zelula laginaren RNA atera ondoren, gehitu lisi-disoluzioari eta izotz-kutxan lisatu.

3. Hobe da nitrogeno likidoa erabiltzea ehotzeko ehun-laginak homogeneizatzen direnean.Nitrogeno likidorik gabeko homogeneizatzaile elektrikoa erabiltzen duzunean, arreta jarri homogeneizatu-egokitzailea guztiz aldez aurretik hozteari.

Bigarrena DNasa exogenoa da

1.Guztiz armatuta egon, laborategiko bata jantzi, mozorroa jantzi, eta ziurtatu eskularru berri bat (ez izan hain errespetua!! Kontuan izan behar da Trizol oso korrosiboa dela, eta eskularruen bidez ere oso indartsua dela, beraz, ez ezazu eskuetan tantaka bota).

2.Erabilitako pipeta-puntak, EP hodiak, PCR hodiak eta beste ekipo guztiak des-RNasa tratatu behar dira.%0,1eko DEPCn busti daiteke eta gero presio handian presioratu.Kontuz kanpaia baten funtzionamenduari.Bertako tiranoek zuzenean erosi ditzakete kontsumigarriak entzimak kentzeko.

PS: Utzidazu metodo alferra bat esaten.Tenperatura altuak eta presio altuak RNasa guztiz kendu ezin badute ere, haren zati handi bat kenduko du.Tenperatura eta presio altuak bi aldiz eragin ona du, eta RNA erauzteak eragin txikia du.

3.Alkoholak proteinak desnaturaliza ditzake,beraz, RNA erauzteko mahaia %75eko alkoholarekin garbitu daiteke , eta eskularruak ere alkoholarekin ihinztatu daitezke.

4.Azken RNA disolbatzeko disoluzioa eta zentrifugatzailearen hodia ere de-RNasa tratatu behar da.DEPC ura normalean erabiltzen den RNA disolbatzeko soluzioa da.Hitz egin dezagun DEPC uraren prestaketa metodo zuzenari buruz (gogoratu DEPC komertziala erostean berriro ontziratu behar duzula)

Gehitu DEPC ur ultrapuruari 1:1000, ondo astindu, utzi gau osoan zehar 37 °C-tan eta esterilizatu 121 °C-tan tenperatura eta presio altuan 15 minutuz.DEPC ura -20 °C-tan gorde daiteke 1 ml alikuotan.

Azkenik, laburbilduz: tenperatura baxua da gakoa, kontsumigarriak ondo maneiatzen dira, guztiz armatuta eta gutxiago hitz egiten!

Tira, horixe da gaurko estrategiarako.Aipatu duzun RNA kontzentrazio eta garbitasun guztia opa dizut.A260/A280 biak 2.0 dira!!!

Jakina, a erabiltzen baduzugiro-tenperaturan funtzionamendua RNA erauzteko kit, baliteke goiko arazoak ez topatzea.

Giro-tenperaturan funtzionatzeak, DNasa gehitu gabe, zeluletatik RNA osoa ateratzen du 11 minututan, eta animalia ehunetatik edo landareetatik RNA osoa 30 minututan ateratzen du.

Proba laginak lortzeko, jarri harremanetan:overseas@foregene.com

Erlazionatutako produktuak:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/