Denbora errealeko PCR, PCR kuantitatiboa edo qPCR izenez ere ezaguna, denbora errealean PCR anplifikazio produktuen jarraipena eta analisia egiteko metodo bat da.
PCR kuantitatiboak funtzionamendu sinplea, azkarra eta erosoa, sentsibilitate handia, errepikakortasun ona eta kutsadura-tasa baxuaren abantailak dituelako, oso erabilia da medikuntza proban, sendagaien eraginkortasunaren ebaluazioan, gene adierazpenaren ikerketan, ikerketa transgenikoan, geneen detekzioan, patogenoen detekzioan, animalien eta landareen detekzioan., elikagaien probak eta beste arlo batzuk.
Hori dela eta, bizitza zientzietako oinarrizko ikerketetan diharduten ala ez farmazia-enpresetako, abeltzaintzako enpresetako, elikagai-enpresetako langileak, edo baita sarrera-irteeretako ikuskapen eta berrogeietako bulegoetako langileak, ingurumena zaintzeko departamentuetako, ospitaleetako eta beste unitateetako langileak, gehiago edo gutxiago jasango dituzu Edo PCR kuantitatiboa menderatzeko ezagutzak ezagutu behar dituzu.

Denbora errealeko PCRren printzipioa

Denbora errealeko PCR PCR erreakzio sistemari substantzia fluoreszenteak gehitzen zaizkion metodo bat da, eta PCR erreakzio prozesuan fluoreszentzia seinalearen intentsitatea denbora errealean kontrolatzen da PCR tresna kuantitatibo baten bidez, eta azkenik, datu esperimentalak aztertu eta prozesatzen dira.

【Anplifikazio-kurba】PCRren prozesu dinamikoa deskribatzen duen kurba da.PCRren anplifikazio-kurba ez da benetan kurba esponentzial estandarra, kurba sigmoide bat baizik.

[Anplifikazio-kurbaren plataforma fasea]PCR zikloen kopurua handitzearekin, DNA polimerasa inaktibatzearekin, dNTP eta abiarazleen agortzearekin eta erreakzioaren azpiproduktu pirofosfatoaren sintesi-erreakzioaren inhibizioarekin, etab., PCR ez da beti esponentzialki hedatzen., eta azkenean lautada batean sartuko da.

[Anplifikazio kurbaren hazkunde esponentziala eskualdea]Plateraren fasea asko aldatzen den arren, anplifikazio-kurbaren hazkunde esponentzialaren eskualdeko eskualde jakin batean, errepikagarritasuna oso ona da, eta hori oso garrantzitsua da PCRren analisi kuantitatiborako.

[Atalasearen balioa eta Ct balioa]Fluoreszentzia detektatzeko muga-balioa anplifikazio-kurbaren hazkunde esponentzialeko eremuan dagokion posizioan ezarri dugu, hots, atalasearen balioa (Threshold).Atalase-balioaren eta anplifikazio-kurbaren ebakidura Ct balioa da, hau da, Ct balioa atalase-balioa iristen denean ziklo-kopuruari (Threshold Cycle) aipatzen da.

Beheko grafikoak argi erakusten du atalase-lerroaren eta anplifikazio-kurbaren, atalasearen eta Ct balioaren arteko erlazioa.

【Nola kuantifikatu?】

Teoria matematikoaren bidez frogatu da Ct balioak hasierako txantiloien kopuruaren logaritmoarekin alderantzizko erlazio lineala duela.Denbora errealeko PCR PCR anplifikazio produktuak denbora errealean kontrolatzen ditu eta anplifikazio esponentzialeko fasean kuantifikatzen ditu.

PCR ziklo bakoitzeko, DNA 2 aldiz esponentzialki handitu zen, eta laster lautada batera iritsi zen.

Hasierako DNAren kopurua A dela suposatuz₀ , n zikloren ondoren, DNA produktuaren kantitate teorikoa honela adieraz daiteke:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Orduan, zenbat eta A 0 hasierako DNA-kopurua handiagoa izan, orduan eta lehenago iritsiko da anplifikatutako produktuaren kantitatea An detekzio-baliora, eta An-era iristean ziklo-kopurua Ct balioa da.Hau da, zenbat eta A 0 hasierako DNA-kopuru handiagoa izan, orduan eta lehenago anplifikazio-kurba gailurra izango da, eta, horren arabera, n ziklo-kopurua txikiagoa da.

Ezagutzen den kontzentrazio estandarraren gradiente-diluzioa egiten dugu eta denbora errealeko PCRrako txantiloi gisa erabiltzen dugu, eta anplifikazio-kurba sorta bat lortuko da tarte berdinetan, hasierako DNA-kopuruaren ordenan, gehiagotik gutxiagora.Ct balioaren eta hasierako txantiloien kopuruaren logaritmoaren arteko erlazio linealaren arabera, a[kurba estandarra] sor daiteke.

Kontzentrazio ezezaguna duen laginaren Ct balioa kurba estandarrean ordezkatuz, kontzentrazio ezezaguna duen laginaren hasierako txantiloiaren kantitatea lor daiteke, hau da, denbora errealeko PCRren printzipio kuantitatiboa.

Denbora errealeko PCR detektatzeko metodoa

Denbora errealeko PCR-k PCR anplifikazio-produktuak detektatzen ditu erreakzio-sistemako fluoreszentzia-intentsitatea detektatuz.

Tindagai fluoreszenteak barneratzeko metodoaren printzipioa】

Tindagai fluoreszenteak, hala nola TB Green ® , PCR sistemetan kate bikoitzeko DNArekin lotu daiteke eta lotzean fluoresztu egin daiteke.

Erreakzio-sistemako fluoreszentzia-intentsitatea esponentzialki handitu zen PCR zikloak handitzean.Fluoreszentzia-intentsitatea detektatuz, erreakzio-sistemako DNAren anplifikazio-kopurua denbora errealean kontrolatu daiteke, eta, ondoren, laginaren hasierako txantiloiaren zenbatekoa alderantziz kalkula daiteke.

【Zunda fluoreszenteen metodoaren printzipioa】

zunda fluoreszenteaazido nukleikoen sekuentzia bat da, 5' muturrean talde fluoreszente bat eta 3' muturrean itzaltze-talde bat dituena, txantiloiari berariaz lotu daitekeena.Zunda osorik dagoenean, fluoroforoak igorritako fluoreszentzia itzali egiten du talde itzaltzaileak eta ezin du fluoreszentziarik eman.Zunda deskonposatzen denean, substantzia fluoreszentea disoziatuko da eta fluoreszentzia igorriko du.

PCR erreakzio-soluzioari zunda fluoreszente bat gehitzen zaio.Annealing prozesuan zehar, zunda fluoreszentea txantiloiaren posizio zehatzera lotuko da.Hedapen prozesuan, PCR entzimaren 5′→3′ exonukleasa jarduerak txantiloiarekin hibridatutako zunda fluoreszentea deskonposatu dezake, eta substantzia fluoreszentea disoziatu egiten da fluoreszentzia igortzeko.Erreakzio-sisteman zundaren fluoreszentzia-intentsitatea detektatuz, PCR produktuaren anplifikazio-kantitatea kontrolatzeko helburua lor daiteke.

【Fluoreszentzia detektatzeko metodoa hautatzea】

Homologia handiko sekuentziak bereizteko eta PCR detekzio multiplexa egiteko erabiltzen bada, hala nola SNP tipifikazioaren analisia, zunda fluoreszentearen metodoa ordezkaezina da.
Beste denbora errealeko PCR esperimentuetarako, kimera fluoreszente metodo sinple, erraz eta kostu baxuko bat erabil daiteke.

zundak Espezifikotasun sendoa, PCR multiplexatzeko gai

Gabezia

Anplifikaziorako espezifikotasun handiko eskakizunak;

PCR multiplexa ezin da egin Zunda espezifikoak diseinatu behar, kostu handia;

batzuetan zundaren diseinua zaila da

Erlazionatutako produktuak: