RT-qPCR biologia molekularraren oinarrizko esperimentua da, eta guztiek ezagutu behar dute.Batez ere hiru urrats biltzen ditu: RNA erauzketa, alderantzizko transkripzioa cDNAra eta denbora errealeko PCR kuantitatibo fluoreszentea.Ez du laguntzen, zer gertatzen ari da?Litekeena da arazoren bat egoteaalderantzizko transkripzioaren esperimentua!Alderantzizko transkripzioaren esperimentuak RNA, dNTP, abiarazleak eta abiarazleak gehitu behar dituela dirudien arrenalderantzizko transkriptasazentrifuga-hodira eta ondo nahastu, baina benetako funtzionamendu-prozesuan, oraindik ere arreta jarri behar zaien xehetasun asko daude.Ikas dezagun horri buruz!

Nola epaitu RNAren kalitatea?
cDNA lortzeko, RNAren kalitatea funtsezkoa da!RNAren kalitatea bi alderditatik detekta daiteke batez ere:
(1) RNAren osotasuna:RNAren osotasuna agarosa gel elektroforesiaren bidez egiaztatu daiteke. Eukariotoak adibidetzat hartuta, RNA osoak hiru banda garbi ditu, handitik txikira bitarteko pisu molekularrak 28S, 18S eta 5S dira eta 28S 18S baino bi aldiz distiratsuagoa da;hiru banda ikusten badira, baina banda mota lausotuta dago edo Difusioak esan nahi du RNA partzialki degradatuta dagoela.Une honetan, mesedez egin alderantzizko transkripzioaren erreakzioa berehala eta handitu txantiloiaren sarrera behar bezala;pisu molekular txikiko edo bandarik ez duen banda bat bakarrik ikusten bada, RNA erabat degradatu da eta berriro atera behar da.Agilent 2100-k RNAren osotasuna adierazten du gailur diagramarekin eta RIN balioarekin.Azido nukleikoa osorik badago, elektroferogramaren oinarri-lerroa laua da;azido nukleikoa oso degradatuta badago, oinarri-lerroa irregularra da eta degradazio-gailur gehiago agertzen dira;RIN balioak RNAren osotasuna islatzen du, 0-10 bitarteko tartean, zenbat eta handiagoa izan balioa, orduan eta hobea izango da RNAren kalitatea.Tira, zenbat eta osotasun maila handiagoa.
(2) RNAren purutasuna:OD260/280 erlazioa UV espektrofotometria bidez hauteman daiteke.OD260/280 ratioa 1,9 eta 2,1 artekoa bada, garbitasuna oso ona da.
Hondar-DNA genomikoak emaitza kuantitatibo okerrak ekar ditzake
RNA ateratzen denean, lortzen dugun RNA garbitu ez den DNA genomikoarekin (gDNA) nahastea izan daiteke.Beraz, alderantzizko transkripzioaren ondoren cDNA ere nahastuko dagDNA.Behean zeharqPCRerreakzioa,cDNAeta gDNA aldi berean anplifikatu daiteke, CT balio txiki samarra lortuz, eta, beraz, emaitzak alboratuak izan daitezke.
Beraz, zer egin behar dugu egoera honetan?Foregeneproposatzen du:
(1) Egin genomaren garbiketa alderantzizko RNAan, RNA erauzketan zutabe erauzketa bidez kendu daitekeena;
(2) Erauzitako RNA DNasarekin tratatuI , baina amaitu EDTArekin;
alderantzizko transkripzio erreaktiboengenoma garbitzeko moduluekin;

Nola aukeratu abiarazleak alderantzizko transkripziorako?
Alderantzizko transkripzioaren abiarazleek alderantzizko transkripzioaren erreakzioaren emaitza ere eragiten dute.Ausazko abiarazleak, Oligo dT edo geneen espezifikoak hauta ditzakezu alderantzizko transkripziorako, esperimentuaren egoera zehatzen arabera:
(1) Espediente espezifikoak: geneen espezifikoak diren lehengaiak gomendatzen dira;
(2) Zati luzeen transkripzioak: Oligo dT/geneen espezifikoak lehengaiak gomendatzen dira;
(3) Segmentu luzeko transkripzioen barne zatiak: gene-hastapen espezifikoak/ ausazko abiarazleak /ausazko abiarazleak + Oligo dT.Ondorengo qPCR esperimentua egiten bada, Oligo dT ezin da bakarrik erabili, Oligo dT bakarrik erabiltzeak 3′ amaierako alborapena eragin dezakeelako, qPCR esperimentuaren emaitza okerrak sor ditzakeelako;
(4) miRNA: Stem-loop primerak edo tailing primerak erabil daitezke.

Zenbat aldiz diluitu behar da alderantzizko transkripzio produktuaren cDNA kuantifikaziorako?
Alderantzizko transkripzio produktuaren cDNA lortu ondoren, cDNA zenbat aldiz diluitu behar den qPCR esperimentuetarako oso garrantzitsua da.cDNAren kontzentrazioa altuegia edo baxuegia bada, anplifikazio-eraginkortasuna eragin dezake.Neurtu al daiteke cDNAren kontzentrazioa, eta nola egin behar da?
(1) Alderantzizko transkripzio-produktuaren cDNA-ren kontzentrazioa ezin da neurtu, cDNA produktuaz gain, alderantzizko transkripzio-produktuak alderantzizko transkripzio hondar Buffer, alderantzizko transkriptasa, abiarazleak eta abar ere baditu, eta horrek kontzentrazio-neurketaren emaitzak oztopatuko ditu eta OD260/280, OD260/ 230 ratioa eragingo du eta, beraz, ez du benetako cDNA anormala islatzen.Une honetan, lagun batzuek esango dute, orduan neurtuko dut kontzentrazioa garbitu ondoren;hemen, Foregene-k gogorarazi nahi du cDNA ez dela araztzea gomendatzen, alderantziz lortutako cDNAren luzera ezberdina delako, eta cDNA laburra arazketan galduko delako.
(2) Orduan, zer egin?qPCR esperimentuaren aurretik, cDNAren diluzio-gradientea aurre-esperimentuaren bidez zehaztu daiteke.Adibidez: erabili cDNA stock-disoluzioa, 10 aldiz diluzioa eta 100 aldiz diluzioa qPCR esperimentuetarako txantiloi gisa, eta hautatu 18-28 bitarteko CT balioa duen diluzio-faktorea.

Nola transkribatu behar dira miRNAak alderantziz?
miRNA kate bakarreko molekula txikiko RNA bat da, 22 nt inguruko tamaina duena, proteina kodetzen ez duena.Bere luzera laburra dela eta, qPCR metodo konbentzionala zaila da zuzenean kuantifikatzea, beraz, askotan beharrezkoa da miRNA hedatzea;miRNArako alderantzizko transkripzio metodoak zurtoin-begizta metodoa eta buztanaren metodoa dira.
Stem-loop metodoa miRNA luzatzea da zurtoin-begizta abiarazleak gehituz.Detekzio-metodo honek sentsibilitate eta espezifikotasun handiagoa du, baina detekzio-erritmoa baxua da.Alderantzizko transkripzio batek miRNA bakarra eta barne erreferentzia bat detektatu ditzake;isatsa gehitzeko metodoa bi osatzen dute Bi entzimen elkarrekintzarekin osatzen da, hau da, PolyA polimerasa eta alderantzizko transkriptasa.PolyA polimerasa miRNAri PolyA isatsak gehitzeaz arduratzen da bere luzera handitzeko, eta alderantzizko transkriptasak alderantzizko transkripzio erreakzioa egiten du.Metodo honek detekzio-maila handia du eta miRNA eta barne-erreferentzia anitz detektatu ditzake alderantzizko transkripzio batean, baina sentsibilitatea eta espezifikotasuna baxuak dira stem-loop metodoan.