Denek hitz egiten dute qRT-PCR esperimentuaren printzipioaz, lehen diseinuaz, emaitzen interpretazioaz, etab., baina qRT-PCRren eragiketa esperimentala zurekin partekatu beharko nukeela uste dut.Txikia da, baina emaitzei buruzkoa da.
qRT-PCR egin aurretik, gure RNA eta eragiketa metodoak argi ulertu behar ditugu.Azken finean, gure ahaleginak emaitzak lortzera zuzenduta daude, praktikatzera baino.Beraz, qRT-PCR egin aurretik, honako gai hauek zehaztu behar ditugu (horietako batzuk SYBR-rako soilik aplikagarriak dira).
1 Ziur zure RNA ez dagoela degradatuta?
NanoDrop 2000-k RNAren kontzentrazioa eta purutasuna soilik detektatu ditzake, baina ezin du detektatu RNAren osotasuna.
RNA (RNA Intesity Number) balioak Agilent 2100 Bioanalyzer sistemak detektatzen duen RNAren osotasuna isla dezake.
Irudia ARN lagin ezberdinetarako (eukariotoak) RIN balioen diagrama eskematikoa
Hala ere, laborategiek, oro har, ez dute Agilent 2100 Bioanalyzer.Kasu honetan, formaldehido gelaren bidez detekta dezakegu, baina RNA kopuru osoaren eskakizuna handia da, beraz, metodorik azkarrena gel elektroforesi arrunta erabiltzea da.Nukleasarik gabeko ingurunean egon behar da, beraz, beharrezkoa da elektroforesi depositua, sol botila, gel-euskarria eta orrazi DEPC urarekin garbitu.Agarosa ere nukleasarik gabekoa da (betiere ireki berria bada), eta Loading Buffer-a ahalik eta gehien ireki behar da, %1,2ko gelarekin.
Kontuan izan gela guztiz disolbatu behar dela, bestela banda deshomogeneoak eragingo dituela, irudiko 9. laginak erakusten duen moduan.Tentsioa altuegia bada edo luzeegia martxan bada beroa sortuko du eta RNA degradazioa eragingo du, beraz, tentsioa eta denbora zentzuz kontrolatu behar dira.Horrez gain, gelaren exekuzioak laginaren DNA hondakinik dagoen ala ez eta dispensazio-putzuan atxikitako banda kopuru handia dagoen ikus dezake.
Irudia.ARNaren gel elektroforesiaren detekzioa
2 Ziur al zaude zure cDNAren kontzentrazioaz?
Anaia handien laborategiko esperientzia da inbertsio bakoitzak lortutako 20 ul sistemaren cDNA zuzenean 20X diluitzen dela, eta doktoretza osteko ahizpak 10X diluitzen direla.Normalean egoeraren araberakoa naiz.Pertsona bakoitzak aipatzen duen RNAren kalitatea desberdina denez, alderantzikatzeko maila ere ezberdina da, eta baliteke alderantzikatzeko teknologia egonkorra ez izatea.
Beraz, alderantzizko cDNA lortzen dudan bakoitzean, lehenik eta behin 3 bat aldiz diluituko dut, eta gero etxeko genea erabiliko dut RT-PCR egiteko, ziklo kopurua, oro har, 25 ziklokoa da, kontzentrazio espezifikoa identifikatzeko eta, ondoren, azken diluzio-faktorea zehazteko.
3 Ziur zure inprimagailuak erabiltzeko errazak direla?
qRT-PCRren urtze-kurba pasa dezake, baina horrek dirua kostatzen du.Diru askorik gabeko laborategietarako, abiarazle asko lortzen dituztenean, RT-PCR arrunta erabil dezakete banda bakarra den ikusteko eta abiarazleen espezifikotasuna identifikatzeko.Laborategia dirurik gabe geratzen ez bada, inprimagailu guztien espezifikotasuna behin identifika daiteke urtze-kurbaren bidez.
4 Ziur al zaude zure baldintza esperimentalak egokiak direla?
SYBR argi indartsuetatik babestuta egon behar da, beraz, saiatu goiko argia itzaltzen SYBR erreaktiboa gehitzen duzunean, eta argi iluna erabili behar duzu osatzeko.
Gorde SYBR 4 °C-tan.Erabiltzen duzunean, astiro-astiro irauli gora eta behera ondo nahasteko aparra saihesteko, eta ez zurrunbilo indartsu.
Ahizpa gazte batzuek PCR taulan markak marraztea gustatzen zaie laginak nahasteko beldurrez, eta hori oker dago.Zure markatzaileak seinale fluoreszenteen bilduman eragina izango duelako, oro har, gazteei gomendatzen diet memorian laguntzeko koaderno esperimentalak erabiltzea, behean erakusten den moduan.
Irudia.qRT-PCR laginak kargatzeko diagrama
5 Ziur ondo egiten ari zarela?
Ziurtatu eskularruak jantzi, eskularruak, eskularruak jantzi eta gauza garrantzitsuak hiru aldiz esan.
SYBR-ren argiarekiko esposizioa murrizteko, pertsonalki txantiloi bat gehitzea gustatzen zait lehenik, beheko irudian ikusten den bezala.Esperientziaren arabera, txantiloi kopuru txiki bat gehitzeak litekeena da laginketa akatsak sortzea.Hori dela eta, txantiloi kopuru txiki bat gehitzeak eragindako errorea minimizatzeko, normalean lagina berriro bikoiztu egiten dut, eta lagina gehitzean bikoiztu egiten dut gehitutako H2O2 kopurua murrizteko.
Irudia.qRT-PCR kargatzearen diagrama eskematikoa
Ondoren, konfiguratu qRT-PCR sistema honela.
Irudia.qRT-PCR sistema prestatzeko diagrama
OHARRA: konfigurazio prozesua izotzean egin behar da.
Lagina gehitu ondoren, itsatsi zigilatzeko film gardena.Saiatu zigilatzeko film gardenaren gainazala eskuekin ez ukitzen, funtzionatu filmaren bi aldeetako espaziotik.Hatz-markek seinale fluoreszenteen bilketan ere eragina izan dezaketelako.Ondoren, erabili zentrifugatzailea azkar zentrifugatzeko 10 s abiadura baxuan lagina horman zintzilikatzeko.
Erlazionatutako produktuak:
Argitalpenaren ordua: 2023-04-28
