Hasierako materiala: RNA
Alderantzizko transkripzio kuantitatiboa PCR (RT-qPCR) PCR esperimentuetan erabiltzen den metodo esperimentala da RNA abiapuntu gisa erabiliz.Metodo honetan, RNA osoa edo RNA mezularia (mRNA) lehenik eta behin DNA osagarrira (cDNA) transkribatzen da alderantzizko transkriptasa bidez.Ondoren, qPCR erreakzio bat egin zen cDNA txantiloi gisa erabiliz.RT-qPCR biologia molekularreko hainbat aplikaziotan erabili da, besteak beste, gene-adierazpenaren analisian, RNA interferentziaren baliozkotzean, mikroarrayen balioztatzean, patogenoen detekzioan, proba genetikoak eta gaixotasunen ikerketan.
Urrats bakarreko eta bi urratseko metodoak RT-qPCRrako
RT-qPCR urrats bateko edo biko metodo baten bidez lor daiteke.Urrats bakarreko RT-qPCR-k alderantzizko transkripzioa eta PCR anplifikazioa konbinatzen ditu, alderantzizko transkriptasak eta DNA polimerasak erreakzioa hodi berean buffer baldintza berdinetan osatzeko aukera emanez.Urrats bakarreko RT-qPCR-k sekuentzia espezifikoen abiarazleak soilik erabiltzea eskatzen du.Bi urratseko RT-qPCR-an, alderantzizko transkripzioa eta PCR anplifikazioa bi hoditan egiten dira, optimizatutako buffer, erreakzio-baldintza eta primer diseinu estrategia desberdinak erabiliz.
| Abantaila | Desabantaila | |
| Urrats Bat | Metodo honek errore esperimental txikiagoa du bi erreakzioak hodi batean egiten baitira
Pipetatze urrats gutxiago kutsatzeko arriskua murrizten du
Errendimendu handiko anplifikazio/pantailetarako egokia, azkarra eta erreproduzigarria | Bi urratseko erreakzioak ezin dira bereizita optimizatu
Erreakzio-baldintzak bi urratseko erreakzioa konbinatuz arriskuan jartzen direnez, sentikortasuna ez da bi urratseko metodoarena bezain ona.
Lagin bakar batek detektatzen duen helburu kopurua txikia da |
| Bi Urrats | Denbora luzez gorde eta hainbat erreakziotan erabil daitezkeen cDNA liburutegi egonkorrak sortzeko gaitasuna
Helburu-geneak eta erreferentzia-geneak cDNA liburutegi beretik anplifikatu daitezke, cDNA liburutegi anitz behar izan gabe
Erreakzio-buffer eta erreakzio-baldintzak erreakzio bakarreko exekuzioen optimizazioa ahalbidetzen dutenak
Abiarazte-baldintzen aukeraketa malgua | Hainbat hodi eta pipetatze urrats gehiago erabiltzeak DNA kutsatzeko arriskua areagotzen du. eta denbora behar da.
Urrats bakarreko metodoak baino optimizazio gehiago eskatzen du |
Erlazionatutako produktuak:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Urrats bat)-SYBR Green I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Urrats bat)-Taqman
RT Easyᵀᴹ I Master Premix Lehen-katearen CDNA sintesirako
Denbora errealeko PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Denbora errealeko PCR Easyᵀᴹ-Taqman
RNA osoaren eta mRNA hautatzea
RT-qPCR esperimentu bat diseinatzerakoan, garrantzitsua da RNA osoa edo mRNA araztua erabili alderantzizko transkripziorako txantiloi gisa erabakitzea.Nahiz eta mRNA sentikortasun apur bat handiagoa eskaintzeko gai izan, RNA osoa maiz erabiltzen da oraindik.Honen arrazoia da RNA osoak abantaila garrantzitsuagoa duela hasierako material gisa mRNA baino.Lehenik eta behin, prozesuak arazketa-urrats gutxiago behar ditu, eta horrek txantiloiaren berreskurapen kuantitatibo hobea eta emaitzen normalizazio hobea bermatzen du hasierako zelula-zenbakiekin.Bigarrenik, mRNA aberasteko urratsa saihesten du, mRNA ezberdinen berreskurapen ezberdinen ondorioz emaitza okerra ateratzeko aukera saihestu dezakeena.Orokorrean, aplikazio gehienetan xede-genearen kuantifikazio erlatiboa detekzioaren sentsibilitate absolutua baino garrantzitsuagoa denez, RNA osoa egokiagoa da kasu gehienetan.
Alderantzizko transkripzioaren hasiera
Bi urratseko metodoan, hiru metodo ezberdin erabil daitezke cDNA erreakzioa abiatzeko: oligo(dT) abiarazleak, ausazko abiarazleak edo sekuentziari buruzko espezifikoak.Normalean, oligo(dT) abiarazleak eta ausazko lehengaiak konbinatuta erabiltzen dira.Abiarazle hauek txantiloiaren mRNA kateari erantzuten diote eta alderantzizko transkriptasa ematen dute sintesirako abiapuntu batekin.
| Primer hautaketa | Egitura eta funtzioa | Abantaila | Desabantaila |
| Oligo(dT) primer (edo ainguratutako oligo(dT) primer) | MRNA-ren poli(A) isatsean dagoen timina-hondakinen annealing hedatua;aingura oligo(dT) lehengaiak G, C edo A bat dauka 3′ muturrean (aingura gunea) | Luzera osoko cDNAren sintesia poli(A) isatseko mRNAtik
Hasierako material gutxiago dagoenean aplikagarria
Ainguratze guneak ziurtatzen du oligo(dT) abiarazlea mRNAren 5′ poli(A) isatsarekin lotzen dela. | Poli(A) isatsak dituzten geneak anplifikatzeko bakarrik egokia
Lortu lehentze gunetik moztutako cDNA*2 poli(A)-n
Alboratuta 3′ amaierara lotzeko*
*Aukera hori gutxitu egiten da ainguratutako oligo(dT) lehengaiak erabiltzen badira |
| ausazko primer
| 6 eta 9 base arteko luzera dute, RNA transkripzioan zehar gune anitzetara anneal daitezkeenak | RNA guztiei erantzutea (tRNA, rRNA eta mRNA)
Bigarren egitura esanguratsua duten transkripzioetarako egokia da, edo hasierako material gutxiago dagoenean
cDNA etekin handia | cDNA RNA guztietatik alderantziz transkribatzen da, normalean nahi ez dena eta xede-mRNAren seinalea diluitu dezake.
cDNA moztua lortu |
| sekuentziari buruzko abiarazleak | Lehen pertsonalizatuak mRNA sekuentzia zehatzei zuzenduta | cDNA liburutegi espezifikoa
Hobetu sentsibilitatea
Alderantzizko qPCR primerak erabiliz | Xede-gene bakar baten sintesira soilik mugatua |
Alderantzizko transkriptasa
Alderantzizko transkriptasa DNA sintetizatzeko RNA erabiltzen duen entzima bat da.Alderantzizko transkriptasa batzuek RNasa aktibitatea dute eta RNA-DNA kate hibridoetan RNA kateak degrada ditzakete transkripzioaren ondoren.RNase jarduera entzimatikorik ez badu, RNaseH gehi daiteke qPCR eraginkortasun handiagoa lortzeko.Gehien erabiltzen diren entzimak Moloney murine leuzemia birusaren alderantzizko transkriptasa eta hegazti mieloblastoma birusaren alderantzizko transkriptasa dira.RT-qPCRrako, aproposa da termoegonkortasun handiagoa duen alderantzizko transkriptasa bat aukeratzea, horrela cDNA-ren sintesia tenperatura altuagoetan egin ahal izateko, egitura sekundario handiagoa duten RNAen transkripzio arrakastatsua bermatuz, erreakzio osoan jarduera osoa mantenduz, eta ondorioz, cDNA etekin handiagoak lortuko dira.
Erlazionatutako produktuak:
Foreasy M-MLV Alderantzizko Transkriptasa
Alderantzizko transkriptasaren RNasa H jarduera
RNaseH RNA-DNA duplexetatik RNA kateak degradatzeko gai da, kate bikoitzeko DNAren sintesia eraginkorra ahalbidetuz.Hala ere, txantiloi gisa mRNA luzea erabiltzean, RNA goiztiarra degradatu daiteke, eta ondorioz, cDNA moztua sortzen da.Hori dela eta, askotan onuragarria da RNaseH jarduera minimizatzea cDNA klonatzerakoan transkripzio luzeen sintesia nahi bada.Aitzitik, RNasa H jarduera duten alderantzizko transkriptasak onuragarriak izan ohi dira qPCR aplikazioetarako, RNA-DNA duplexen urtzea hobetzen baitute PCRaren lehen zikloan.
Primer diseinua
RT-qPCR-n qPCR urratserako erabiltzen diren PCR-en abiarazleak exoi-exoi juntura bat zabaltzeko diseinatu behar dira, non anplifikazio-hastapen batek exon-introi benetako muga bat izan dezakeen.Introia duten DNA genomikoaren sekuentziak anplifikatzen ez direnez, diseinu honek DNA genomikoa kutsatzearen ondorioz anplifikatutako positibo faltsuak izateko arriskua murrizten du.
Lehenak ezin badira diseinatu exoiak edo exoi-exoien mugak bereizteko, RNA laginak RNasarik gabeko DNasa I edo dsDNasarekin tratatzea beharrezkoa izan daiteke DNA genomikoaren kutsadura kentzeko.
RT-qPCR kontrola
Alderantzizko transkripzioaren kontrol negatiboa (-RT kontrola) RT-qPCR esperimentu guztietan sartu behar da DNAren kutsadura detektatzeko (adibidez, DNA genomikoa edo aurreko erreakzioetako PCR produktuak).Kontrol honek erreakzio-osagai guztiak ditu, alderantzizko transkriptasa izan ezik.Kontrol honekin alderantzizko transkripzioa ez denez gertatzen, PCR anplifikazioa ikusten bada, DNAren kutsadura litekeena da.
Argitalpenaren ordua: 2022-02-02
