Lehen diseinuaren oinarria (% 99ko arazoak konpondu daitezke)
1. Primer luzera: testuliburuak 15-30bp behar ditu, normalean 20bp inguru.Benetako egoera hobe da 18-24bp-a izatea espezifikotasuna ziurtatzeko, baina zenbat eta luzeagoa izan hobe, primer luzeegiak ere espezifikotasuna murriztuko du eta etekina murriztuko du.
2. Primer anplifikazio-tartea: 200-500bp egokia da, eta zatia 10kb-ra heda daiteke baldintza zehatzetan.
3. Primer oinarria: G + C edukiak% 40-60 izan behar du, G + C anplifikazio efektu txikiegia ez da ona, G + C gehiegi erraza da banda ez-espezifikoak agertzea.ATGC hobekien banatzen da ausaz, 5 purina edo pirimidina nukleotido baino gehiagoko multzoak saihestuz.Multi-gc 5' amaierarako eta tarteko sekuentziak egonkortasuna areagotzeko, saihestu GC aberatsa 3' muturrean, GCrik ez azken 3 oinarrietarako edo GCrik ez azken 5 oinarrietatik 3rako.
4. Saihestu bigarren mailako egitura abiarazleetan, eta saihestu bi abiarazleen arteko osagarria, batez ere 3' muturrean osagarria, bestela primer dimeroa sortuko da eta banda anplifikatu ez-espezifikoak sortuko dira.
5. Hastapenen 3' amaierako oinarriak, batez ere azken eta azkenaurreko oinarriak, zorrozki parekatu behar dira, parekatu gabeko oinarri terminalengatik PCR porrota ekiditeko.
6. Abiarazleek mozketa-gune egokiak dituzte edo gehi daitezke, eta anplifikatutako xede-sekuentziak mozketa-gune egokiak izan behar ditu, eta hori oso onuragarria da zatiketa-analisirako edo klonazio molekularra egiteko.
7. Hastapenen espezifikotasuna: abiarazleek ez dute azido nukleikoen sekuentzien datu-baseko beste sekuentzia batzuekin homologia nabarmenik izan behar.
8. Ikasi softwarea erabiltzen: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (online diseinu honek ondoen funtzionatzen du).
Goiko edukiak lehen diseinu-arazoen %99 gutxienez ebatzi dezake.
Kontrolatu lehen diseinuaren xehetasunak
1. Primer luzera
Primeraren luzera orokorra 18 ~ 30 oinarri da.Oro har, inprimagailuaren errekostatzeko tenperatura zehazten duen faktore garrantzitsuena primeraren luzera da.Primeraren errekostatzeko tenperatura orokorrean hautatzen da (Tm balioa -5 ℃), eta batzuek zuzenean Tm balioa erabiltzen dute.Ondoko formulak erabil daitezke, gutxi gorabehera, inprimagailuen erretiro-tenperatura kalkulatzeko.
Primeraren luzera 20bp baino txikiagoa denean: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Primeraren luzera 20bp baino handiagoa denean: 62,3 ℃ + 0,41 ℃ (%GC) -500/luzera-5 ℃
Horrez gain, software asko ere erabil daitezke erretilu tenperatura kalkulatzeko, kalkulu-printzipioa desberdina izango da, beraz, batzuetan kalkulatutako balioak hutsune txiki bat izan dezake.PCR erreakzioak optimizatzeko, 54 ℃ baino gutxiagoko erretiro-tenperaturak bermatzen dituzten abiarazte laburrenak erabiltzen dira eraginkortasun eta espezifikotasun onena lortzeko.
Orokorrean, primer espezifikotasuna lau faktore handitzen da nukleotido gehigarri bakoitzeko, eta, beraz, aplikazio gehienetarako abiarazteen gutxieneko luzera 18 nukleotidokoa da.Primer-luzeraren goiko muga ez da oso garrantzitsua, batez ere erreakzio-eraginkortasunarekin lotuta.Entropia dela eta, zenbat eta luzeagoa izan lehengai, orduan eta abiadura txikiagoa du xede-DNAri lotzeko hari bikoitzeko txantiloi egonkor bat osatzeko DNA polimerasa lotzeko.
Primerak diseinatzeko softwarea erabiltzean, abiarazteen luzera TM balioaren arabera zehaztu daiteke, batez ere fluoreszentzia PCR kuantitatiboko abiarazteetarako, TM=60 ℃ edo kontrolatu behar da.
2.GC edukia
Orokorrean, G+C-ren edukia abiarazte-sekuentzietan % 40 ~ % 60 da, eta abiarazle baten GC edukia eta Tm balioa koordinatu behar dira.Primerak A GC edo AT joera larria badu, A, T edo G eta C isatsaren kantitate egokia gehi daiteke primeraren 5 'muturrean.
3. Errekuzitzeko tenperatura
Erretiro-tenperatura askatze-tenperatura baino 5 ℃ baxuagoa izan behar da.Primer-baseen kopurua txikia bada, egokitze-tenperatura egoki handitu daiteke, eta horrek PCRren espezifikotasuna areagotu dezake.Base-kopurua handia bada, egokitze-tenperatura murriztu daiteke.4 ℃ ~ 6 ℃-ko lehen pare baten arteko erretilu-tenperatura-diferentziak ez du PCR errendimenduan eragingo, baina hobeki lehen-pare baten errekostatzeko tenperatura berdina da, 55 ℃ ~ 75 ℃ artean alda daiteke.
4. Saihestu anplifikazio txantiloiaren bigarren mailako egitura-eremua
Hobe da txantiloiaren bigarren mailako egitura-eskualdea saihestea zati anplifikatua hautatzerakoan.Xede zatiaren bigarren mailako egitura egonkorra aurreikusi eta kalkulatu daiteke dagokion software informatikoaren bidez, eta hori lagungarria da txantiloiak aukeratzeko.Emaitza esperimentalek erakusten dute hedapenak ez duela arrakastarik izaten hedatu beharreko eskualdearen energia librea (△G) 58,6 lkJ/mol baino txikiagoa denean.
5. Helburuko DNArekin desegokia
Anplifikatutako xede-DNA-sekuentzia handia denean, abiarazle bat xede-DNAren atal anitzetara lotu daiteke, eta emaitzan banda anitz agertuko dira.Oraingo honetan beharrezkoa da BLAST software probak erabiltzea, webgunea:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Hautatu Lerrokatu bi sekuentzia (bl2seq).
Hasierako sekuentziak 1. zonan eta helburuko DNAren sekuentziak 2. zonan itsatsi trukagarria da, eta BLASTek aukera osagarriak, zentzuaren aurkakoak eta bestelako aukerak kalkulatzen ditu, erabiltzaileek ez dute ohartu behar bi kateak zentzuzko kateak diren ala ez.GI zenbakia ere sar dezakezu datu-basean sekuentziaren GI zenbakia ezagutzen baduzu, beraz, ez duzu sekuentziaren atal handi bat itsatsi beharrik izango.Azkenik, sakatu Lerrokatu 3an, abiarazleak helburuko DNAn gune homologo anitz dituen ikusteko.
6. Primer terminala
Primeraren 3 'muturra luzapena hasten den lekuan dago, beraz, garrantzitsua da desadostasunak hor hastea saihestea.3 'muturrak ez luke 3 G edo C jarraian baino gehiago izan behar, horrek lehengaia oker abiaraziko duelako G+C aberaste-sekuentziaren eskualdean.3' muturrak ezin du egitura sekundariorik osatu, PCR (AS-PCR) erreakzio berezietan izan ezik, primeraren 3' muturra ezin da bat etorri.Esate baterako, kodetze-eskualdea anplifikatzen bada, primer-aren 3' amaiera ez da kodoiaren hirugarren posizioan amaitu behar, kodoiaren hirugarren posizioa degeneratzeko joera duelako, eta horrek anplifikazioaren espezifikotasuna eta eraginkortasuna eragingo duelako.Eransketa-hastatzaileak erabiltzean, jo kodoiaren erabilera-taulara, erreparatu hobespen biologikoari, ez erabili anexio-hastagailuak 3′-ko muturrean eta erabili lehengaien kontzentrazio handiagoa (1uM-3uM).
7. Primeren egitura sekundarioa
Primerek berek ez lukete sekuentzia osagarririk izan behar, bestela, abiarazleek beraiek ile-egituretan tolestuko dira, eta bigarren mailako egitura honek abiarazleen eta txantiloien loturan eragingo du oztopo esterikoaren ondorioz.Judizio artifiziala erabiltzen bada, primeren oinarri osagarri jarraituek ez dute 3bp baino handiagoa izan behar.Ez da egon behar bi primeren arteko osagarritasunik, batez ere 3 'muturraren gainjartze osagarria saihestu behar da primer dimeroen eraketa saihesteko.Orokorrean, ez da egon behar 4 base jarraian homologia edo osagarritasuna abiarazte pare baten artean.
8. Gehitu markatzaileak edo tokiak
5 'muturrak eragin txikia du anplifikazioaren espezifikotasunean eta, beraz, alda daiteke anplifikazioaren espezifikotasunean eragin gabe.Primer 5 'amaieraren aldaketak honako hauek izan zituen: entzimaren murrizketa gunea gehitzea;Biotina etiketatua, fluoreszentzia, digoxina, Eu3+, etab. Proteinekin lotzeko DNA sekuentziak sartu;Mutazio-guneak sartzea, mutazio-sekuentziak txertatzea eta falta izatea eta sustatzaile-sekuentziak sartzea, etab. Oinarri gehigarriek anplifikazioaren eraginkortasunean eragingo dute gutxi-asko handitu eta primer-dimeroak sortzeko aukera handituko dute, baina kontzesio batzuk egin behar dira hurrengo urratserako.Xede-sekuentzian existitzen ez diren sekuentzia gehigarriak, hala nola, murrizketa guneak eta sekuentziak sustatzaileak, abiaraztearen 5′ amaieran gehi daitezke espezifikotasuna eragin gabe.Sekuentzia hauek ez dira lehen Tm balioen kalkuluan sartzen, baina osagarritasuna eta barne egitura sekundarioa probatu behar dira.
9. Azpiklonak
Gehienetan, PCR aurretiazko klonazioa baino ez da, eta ondoren xede-zatiak hainbat bektoretan azpiklonatu behar ditugu, beraz, PCR urratseko hurrengo eragiketarako oinarri osagarriak diseinatu behar ditugu.
Azpiklonatzeko diseinatutako sekuentzia batzuk laburbiltzen dira jarraian.
Murrizketa endonukleasa mugatzeko gunea gehitu zen
Entzimak murrizteko guneak gehitzea da PCR produktuak azpiklonatzeko metodorik erabiliena.Orokorrean, zatiketa gunea sei base da, 5 'mozketa gunearen amaieraz gain, 2 ~ 3 babes-base gehitu behar dira.Hala ere, entzima ezberdinek behar dituzten babes-base kopurua desberdina da.Adibidez, SalⅠ-k ez du babes-baserik behar, EcoRⅤ-k 1 babes-base behar ditu, NotⅠ-k 2 babes-base behar ditu eta Hind Ⅲ-k 3 babes-base behar ditu.
LIC buztana gehitzen du
LIC-ren izen osoa Ligation-Independent cloning da, Navogen-ek bereziki pET bektorearen zatirako asmatutako klonazio metodoa.LIC metodoaren bidez prestatutako pET eramaileak 12-15 oinarri bakarreko mutur itsaskorrak ez diren osagarriak ditu, helburuko txertaketaren zatian dagozkion mutur itsaskorrak osatzen dituztenak.Anplifikazio-helburuetarako, txertatutako zatiaren primer 5′ sekuentziak LIC bektorea osatu beharko luke.T4 DNA polimerasaren 3′→5′ estranct jarduerak hari bakarreko mutur itsaskor bat sor dezake txertatutako zatian denbora laburrean.Produktua prestatutako txertaketaren zatiaren eta bektorearen elkarrekiko errekuzimendutik soilik era daitekeenez, metodo hau oso azkarra eta eraginkorra da, eta klonazio zuzendua da.
Zuzendutako TA klona buztana gehitu
TA klonak ezin izan zuen zatia bektore batera bideratu, beraz, geroago Invitrogenek klonazioa bideratu zezakeen bektore bat sartu zuen, mutur batean lau GTGGS oinarri nabarmen zituena.Horregatik, PCR abiarazleen diseinuan, sekuentzia osagarriak horren arabera gehitu behar dira, zatiak "orientatu" daitezen.
Denbora gutxi baduzu, sintesi zuzena probatu dezakezu, genea bektorearekin konbinatuz, muskulugileengan ET genearen sintesia deitzen duguna.
D. In-Fusion klonatzeko metodoa
Ez da ligasarik behar, ez da erreakzio luzerik behar.Bektore linealizatuaren bi muturretan sekuentzia bat sartzen den bitartean Abiarazpenen diseinuan, orduan PCR produktua eta bektore linealizatua BSA duen infusio entzimaren disoluzioan gehitzen dira eta ordu erdiz giro-tenperaturan jartzen dira, transformazioa egin daiteke.Metodo hau bereziki egokia da bolumen handiko bihurketa egiteko.
10. Batu primer
Batzuetan, sekuentzia-informazio mugatua soilik ezagutzen da primer diseinuari buruz.Esate baterako, aminoazidoen sekuentzia bakarrik ezagutzen bada, bat-egitea diseina daiteke.Fusion primer bat sekuentzia ezberdinen nahasketa bat da, aminoazido bakarra kodetzen duten base aukera desberdinak adierazten dituztenak.Espezifikotasuna areagotzeko, kodoien erabilera taulara jo dezakezu anexioa murrizteko organismo ezberdinen oinarrizko erabilera-hobespenen arabera.Hipoxantina oinarri guztiekin parekatu daiteke, primeraren errekostatzeko tenperatura murrizteko.Ez erabili erantsitako oinarriak primeraren 3' muturrean, 3' muturrean azken 3 baseen errekostea nahikoa baita PCR gune okerrean hasteko.Primer kontzentrazio handiagoak (1μM eta 3μM) erabiltzen dira, anexio-nahaste askotan abiarazleak ez direlako xede txantiloiaren espezifikoak.
PCR lehengaiakkontrola
1. Primer kantitatea
Primer bakoitzaren kontzentrazioa 0,1 ~ 1 umol edo 10 ~ 100 pmol da.Hobe da behar den emaitza lehengai kopuru txikienarekin sortzea.Primeraren kontzentrazio handiak bat ez datozenak eta anplifikazio ez-espezifikoa eragingo du, eta abiarazteen artean dimeroak sortzeko aukera areagotu egingo du.
2. Primer kontzentrazioa
Primeren kontzentrazioa espezifikotasunari eragiten dio.Primer kontzentrazio optimoa, oro har, 0,1 eta 0,5μM artekoa da.Primer kontzentrazio altuagoek produktu ez espezifikoak anplifikatzen dituzte.
3. Primeraren ontze-tenperatura
Primeretarako beste parametro garrantzitsu bat urtze-tenperatura (Tm) da.Tenperatura hau da abiarazleen eta sekuentzia osagarrien % 50 kate bikoitzeko DNA molekula gisa adierazten direnean.Tm beharrezkoa da PCR annealing tenperatura ezartzeko.Egokiena, abiarazte-tenperatura nahikoa baxua da xede-sekuentziarekin abiarazleen errekuzitu eraginkorra bermatzeko, baina nahikoa altua lotura ez-espezifikoa murrizteko.55 ℃-tik 70 ℃ arteko errekostatzeko tenperatura arrazoizkoa.Erretiro-tenperatura, normalean, primeraren Tm baino 5 ℃ baxuago ezartzen da.
Tm ezartzeko hainbat formula daude, asko aldatzen direnak erabilitako formularen eta abiarazleen sekuentziaren arabera.Formula gehienek Tm balio estimatua ematen dutenez, errekostatzeko tenperatura guztiak abiapuntua baino ez dira.Espezifikotasuna hobetu daiteke errekuzitzeko tenperatura progresiboki igotzen duten hainbat erreakzio aztertuz.Hasi estimatutako Tm-5 ℃-tik behera, eta pixkanaka handitu 2 ℃-ko gehikuntzan erretiro-tenperatura.Erretiro-tenperatura handiagoak lehen dimeroen eta produktu ez-espezifikoen eraketa murriztuko du.Emaitza hoberenak lortzeko, bi primerek gutxi gorabehera Tm balioak izan behar dituzte.Primer-bikoteen Tm aldea 5℃ baino handiagoa bada, abiarazteek hasiera faltsu esanguratsua erakutsiko dute zikloan errekostatzeko tenperatura baxuagoa erabiliz.Bi primer Tm desberdinak badira, ezarri ontzeko tenperatura Tm baxuena baino 5 ℃ baxuagoan.Bestela, espezifikotasuna areagotzeko, bost ziklo egin daitezke lehenik Tm handiagorako diseinatutako erretilu-tenperaturetan, eta, ondoren, gainerako zikloak Tm baxuagorako diseinatutako errezistu-tenperaturetan.Horri esker, helmugako txantiloiaren kopia partziala lortu daiteke baldintza estuetan.
4. Primer purutasuna eta egonkortasuna
Lehen pertsonalizatuen purutasun estandarra egokia da PCR aplikazio gehienetarako.Gatzgabetzearen bidez benzoilo eta isobutililo taldeen kentzea gutxienekoa da eta, beraz, ez du PCR-a oztopatzen.Aplikazio batzuek arazketa behar dute sintesi-prozesuan luzera ez diren sekuentzia guztiak kentzeko.Sekuentzia moztu hauek DNAren sintesi-kimikaren eraginkortasuna %100ekoa ez delako gertatzen dira.Prozesu zirkular bat da, erreakzio kimiko errepikatuak erabiltzen dituena, base bakoitza gehitzen den heinean 3′-tik 5′-ra DNA egiteko.Bi zikloetan huts egin dezakezu.Hastapen luzeagoek, batez ere 50 base baino handiagoak, sekuentzia moztuen proportzio handia dute eta arazketa behar dute.
Primeren etekinak kimika sintetikoaren eta arazketa metodoaren eraginkortasunak eragiten du.Biofarmazia-enpresek, hala nola, Zitologia eta Shengong-ek, guztiek gutxieneko OD unitate bat erabiltzen dute oligonukleosidoaren irteera osoa ziurtatzeko.Primer pertsonalizatuak hauts lehorrean bidaltzen dira.Hobe da hasierakoak TEn berriro disolbatzea, azken kontzentrazioa 100μMkoa izan dadin.TE ur deionizatua baino hobea da, uraren pH-a askotan azidoa baita eta oligonukleosidoen hidrolisia eragingo duelako.
Primeren egonkortasuna biltegiratze baldintzen araberakoa da.Hauts lehorra eta lehengai disolbatuak -20 ℃-tan gorde behar dira.10μM-tik gorako kontzentrazioetan TE-n disolbatutako abiarazleak -20 ℃-tan egonkorki gorde daitezke 6 hilabetez, baina giro-tenperaturan (15 ℃ eta 30 ℃) aste 1 baino gutxiagoan soilik gorde daitezke.Hauts lehorrak -20 C-tan gorde daitezke gutxienez urtebetez eta giro-tenperaturan (15 C eta 30 C) gehienez 2 hilabetez.
5. Entzimak eta haien kontzentrazioa
Gaur egun, erabiltzen den Taq DNA polimerasa bakterio koliformeek sintetizatutako gene-ingeniaritza entzima da funtsean.PCR erreakzio tipiko bat katalizatzeko behar den entzima-kopurua 2,5 U ingurukoa da (100 ul-ko erreakzio-bolumen osoa aipatzen du).Kontzentrazioa altuegia bada, anplifikazio ez-espezifikoa ekar dezake;kontzentrazioa baxuegia bada, produktu sintetikoen kantitatea murriztuko da.
6. dNTPren kalitatea eta kontzentrazioa
dNTPren kalitatea oso lotuta dago PCR anplifikazioaren kontzentrazioarekin eta eraginkortasunarekin.dNTP hautsa pikortsua da, eta bere aldakortasunak bere jarduera biologikoa galtzen du gaizki gordetzen bada.dNTP disoluzioa azidoa da, eta kontzentrazio handian erabili behar da, 1M NaOH edo 1M Tris.HCL buffer soluzioarekin bere PH-a 7.0 ~ 7.5era doitzeko, azpi-ontzi kopuru txikia, izoztutako biltegiratzea -20 ℃-tan.Hainbat izozte-desizozketak dNTP degradatuko du.PCR erreakzioan, dNTP 50 ~ 200 umol/L izan behar da.Batez ere, arreta jarri behar da lau DNTPSen kontzentrazioa berdina izan behar da (mol prestaketa berdina).Horietako baten kontzentrazioa besteekiko desberdina bada (handiagoa edo baxuagoa), bat ez datozenak sortuko dira.Kontzentrazio baxuegiak PCR produktuen etekina murriztuko du.dNTP Mg2+-rekin konbina daiteke eta Mg2+ askearen kontzentrazioa murrizten du.
7. Txantiloia (helburuko genea) azido nukleikoa
Azido nukleikoaren txantiloiaren kantitatea eta purifikazio-maila PCRren arrakastaren edo porrotaren giltzarrietako bat da.DNA arazteko metodo tradizionalek SDS eta K proteasa erabiltzen dituzte aleak digeritzeko eta botatzeko.SDSren funtzio nagusiak hauek dira: zelula-mintzean lipidoak eta proteinak disolbatzea, horrela zelula-mintza suntsituz mintz-proteinak disolbatuz, eta proteina nuklearrak zelularen disoziatzea, SDS proteinekin ere konbinatu eta hauspeatu egin daiteke;Proteasa K proteinak hidrolizatu eta digeritu ditzake, batez ere DNAri loturiko histonak, eta, ondoren, disolbatzaile organikoa fenola eta kloroformoa erabili proteinak eta zelulen beste osagai batzuk erauzteko, eta etanola edo isopropil alkohola erabili azido nukleikoa hauspetatzeko.Erauzitako azido nukleikoa PCR erreakzioetarako txantiloi gisa erabil daiteke.Detekzio kliniko orokorreko laginetarako, metodo azkar eta sinple bat erabil daiteke zelulak disolbatzeko, patogenoak lisatzeko, kromosometatik proteinak digeritzeko eta kentzeko xede-geneak askatzeko, eta zuzenean PCR anplifikaziorako erabil daiteke.RNA txantiloiaren erauzketa normalean guanidina isotiozianatoa edo proteasa K metodoa erabiltzen du RNasak RNA degrada ez dezan.
8.Mg2+ kontzentrazioa
Mg2+ek eragin handia du PCR anplifikazioaren espezifikotasunean eta etekinean.PCR erreakzio orokorrean, hainbat dNTPren kontzentrazioa 200 umol/L denean, Mg2+-ren kontzentrazio egokia 1,5 ~ 2,0 mmol/L da.Mg2+ kontzentrazioa altuegia da, erreakzioaren espezifikotasuna gutxitzen da, anplifikazio ez-espezifikoa gertatzen da, kontzentrazio baxuegiak Taq DNA polimerasaren jarduera murriztuko du, erreakzio-produktuen murrizketa eraginez.
Magnesio ioiek PCRren hainbat alderdi eragiten dituzte, hala nola, DNA polimerasaren jarduera, eta horrek etekina eragiten du;Beste adibide bat primer annealing da, eta horrek espezifikotasuna eragiten du.dNTP eta txantiloia magnesio ioiarekin lotzen dira, entzimaren jarduerarako beharrezkoa den magnesio ioi askearen kopurua murriztuz.Magnesio ioiaren kontzentrazio optimoa hasierako bikote eta txantiloi desberdinetarako aldatzen da, baina 200μM dNTP-rekin PCR hasierako kontzentrazio tipikoa 1,5 mM da (oharra: denbora errealeko PCR kuantitatiborako, erabili 3 eta 5 mM magnesio ioien soluzioa zunda fluoreszente batekin).Magnesio ioi askeen kontzentrazio altuagoek etekina handitzen dute, baina anplifikazio ez-espezifikoa areagotzen dute eta fideltasuna murrizten dute.Kontzentrazio optimoa zehazteko, magnesio ioien titrazioak 1mM-tik 3mM-ko 0,5mM-ko gehikuntzan egin ziren.Magnesio ioien optimizazioaren menpekotasuna murrizteko, Platinum Taq DNA polimerasa erabil daiteke.Platinozko Taq DNA polimerasa Taq DNA polimerasa baino magnesio ioi-kontzentrazio zabalagoan funtzioa mantentzeko gai da eta, beraz, optimizazio gutxiago behar du.
9. Pcr-a sustatzeko gehigarriak
Annealing-tenperatura, primer diseinua eta magnesio ioien kontzentrazioa nahikoa da txantiloi gehienen anplifikazio espezifikorako;hala ere, txantiloi batzuek, GC eduki handia dutenek barne, neurri osagarriak behar dituzte.DNAren urtze-tenperaturan eragina duten gehigarriek produktuaren espezifikotasuna eta etekina hobetzeko beste modu bat eskaintzen dute.Emaitza onenak lortzeko txantiloiaren erabateko desnaturalizazioa behar da.
Horrez gain, egitura sekundarioak primer lotzea eta entzimaren hedapena eragozten ditu.
PCR gehigarriek, formamida, DMSO, glizerina, betaina eta PCRx Enhancer Solution barne, anplifikazioa hobetzen dute.Haien mekanismo posiblea urtze-tenperatura murriztea da, eta, horrela, abiarazleen errekostea eta DNA polimerasa egitura sekundarioaren eskualdean hedatzen laguntzen du.PCRx irtenbideak beste abantaila batzuk ditu.Magnesio ioien optimizazio minimoa behar da Platinum Taq DNA polimerasa eta Platinum Pfx DNA polimerasarekin erabiltzen denean.Horrela, Platinozko teknika gehigarriarekin konbinatzen da espezifikotasuna areagotzeko hirugarren ikuspegiaren menpekotasuna murrizten duen bitartean, magnesio ioien optimizazioa.Emaitza onenak lortzeko, gehigarrien kontzentrazioa optimizatu behar da, batez ere DMSO, formamida eta glizerola, Taq DNA polimerasa inhibitzen dutenak.
10. Hasiera beroa
Hot start PCR PCR espezifikotasuna hobetzeko metodo garrantzitsuenetako bat da, hasierako diseinu onaz gain.Taq DNA polimerasaren luzapen-tenperatura optimoa 72 ℃ den arren, polimerasa aktibo mantentzen da giro-tenperaturan.Horrela, produktu ez-espezifikoak ekoizten dira PCR erreakzioaren prestaketan eta ziklo termikoaren hasieran euste-tenperatura errekuzitzeko tenperatura baino baxuagoa denean.Eratu ondoren, produktu ez-espezifikoak modu eraginkorrean handitzen dira.Hot-start PCR bereziki eraginkorra da lehen diseinurako erabiltzen diren guneak elementu genetikoen kokapenak mugatuta daudenean, hala nola gunera zuzendutako mutazioak, adierazpen-klonazioa edo DNA ingeniaritzarako erabilitako elementu genetikoak eraikitzea eta manipulatzea.
Taq DNA polimerasaren jarduera mugatzeko ohiko metodo bat PCR erreakzio-soluzioa izotzean prestatzea eta aurrez berotutako PCR aparatu batean jartzea da.Metodo hau sinplea eta merkea da, baina ez du entzimaren jarduera osatzen eta, beraz, ez du produktu ez-espezifikoen anplifikazioa guztiz ezabatzen.
Priming termikoak DNAren sintesia atzeratzen du funtsezko osagai bat inhibituz, PCR aparatua desnaturalizazio-tenperaturara iritsi arte.Eskuzko abiarazte termikoko metodo gehienak, Taq DNA polimerasaren gehikuntza atzeratua barne, astunak dira, batez ere errendimendu handiko aplikazioetarako.Beste prebatze termiko batzuek argizarizko ezkutu bat erabiltzen dute funtsezko osagai bat ixteko, magnesio ioiak edo entzimak barne, edo osagai erreaktiboak fisikoki isolatzeko, hala nola txantiloiak eta bufferak.Ziklo termikoan zehar, hainbat osagai askatu eta elkarrekin nahasten dira argizaria urtu ahala.Eskuzko abiarazte beroaren metodoa bezala, argizarizko ezkutuaren metodoa astuna eta kutsatzeko joera du eta ez da egokia errendimendu handiko aplikazioetarako.
Platinozko DNA polimerasa erosoa eta eraginkorra da PCR abiarazte bero automatikoa egiteko.Platinozko Taq DNA polimerasa Taq DNA polimerasa birkonbinatuz osatuta dago, Taq DNA polimerasaren aurkako antigorputz monoklonalarekin konbinatuta.Antigorputzak PCR bidez formulatzen dira tenperatura luzean mantentzen den entzimen jarduera inhibitzeko.Taq DNA polimerasa erreakzioan askatu zen desnaturalizazio-urratsaren 94℃-ko isolamenduan, polimerasaren jarduera osoa berreskuratuz.Hasiera termikorako kimikoki eraldatutako Taq DNA polimerasaren aldean, Platino-entzimak ez du isolamendu luzerik behar 94 ℃-tan (10 eta 15 minutu) polimerasa aktibatzeko.PlatinumTaq DNA polimerasarekin, Taq DNA polimerasaren jardueraren % 90 berreskuratu zen 2 minutu igaro ondoren 94 ℃-tan.
11. Nest-PCR
Segidan anplifikazio errondak habiaratuak erabiliz, espezifikotasuna eta sentikortasuna hobetu ditzakete.Lehenengo txanda 15 eta 20 zikloko anplifikazio estandarra da.Hasierako anplifikazio-produktuaren zati txiki bat 100 eta 1000 aldiz diluitu zen eta bigarren anplifikazio txandan gehitu zen 15 eta 20 ziklotan.Bestela, hasierako produktu anplifikatua gelaren arazketa bidez neurtu daiteke.Anplifikazioaren bigarren txandan habiaratuta dagoen abiarazlea erabiltzen da, lehen abiarazlearen barruko xede-sekuentziara lotu daitekeena.Habiaratutako PCR erabiltzeak helburu-gune anitzen anplifikazio-aukera murrizten du, abiarazte bi multzoen osagarri diren helburu-sekuentzia gutxi daudelako.Ziklo kopuru berdinak (30 eta 40) abiarazle berdinekin gune ez-espezifikoak anplifikatu zituen.Habiaratutako PCR xede-sekuentzia mugatuen sentsibilitatea handitzen du (adibidez, mrna arraroak) eta PCRS zailen espezifikotasuna hobetzen du (adibidez, 5′ RACE).
12. PCR beherakorra
PCR jaitsierak espezifikotasuna hobetzen du PCRren lehen zikloetan errekostatzeko baldintza estuak erabiliz.Zikloa erretiro-tenperaturan hasten da gutxi gorabehera Tm estimatua baino 5 ℃ altuagoan, gero ziklo bakoitza 1 ℃-tik 2 ℃-ra murrizten da, harik eta errekuntza-tenperatura Tm 5 ℃ baino txikiagoa izan arte.Homologiarik handiena duen helmuga txantiloia bakarrik anplifikatuko da.Produktu hauek hurrengo zikloetan hedatzen jarraitzen dute, produktu ez-espezifikoak anplifikatzen dituztenak.Beheranzko PCR erabilgarria da primer eta xede txantiloiaren arteko homologia-maila ezagutzen ez den metodoetarako, hala nola AFLP DNA hatz-markak egiteko.
Erlazionatutako PCR Kitak
PCR Easyᵀᴹ (koloratzailearekin)
2× PCR HeroTMMix sistemak PCR inhibitzaileekiko tolerantzia handiagoa du PCR Mix sistema arruntak baino, eta erraz aurre egin diezaioke hainbat txantiloi konplexuen PCR anplifikazioari.Erreakzio-sistema bereziak eta eraginkortasun handiko Taq Hero-k PCR erreakzioak anplifikazio-eraginkortasun, espezifikotasun eta sentsibilitate handiagoak ditu.
PCR Heroᵀᴹ (koloratzailearekin)
Anplifikazio-eraginkortasun handiagoa
5'→3' DNA polimerasa jarduera eta 5'→3' exonukleasa jarduera ditu, 3'→5' exonukleasa jarduerarik gabe.
Denbora errealeko PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Espezifikoak: tapoi optimizatuak eta abiarazte beroko Taq entzimak anplifikazio ez-espezifikoa eta primer dimeroen sorrera ekidin ditzake.
Sentsibilitate handia: txantiloiaren kopia baxuak hauteman ditzake
Kitak Foregene alderantzizko transkripzio erreaktibo berezia eta Foregene HotStar Taq DNA polimerasa erabiltzen ditu erreakzio-sistema berezi batekin konbinatuta, erreakzioaren anplifikazio-efizientzia eta espezifikotasuna eraginkortasunez hobetzeko.
Argitalpenaren ordua: 2023-09-05
