RT-qPCR esperimentuak RNA erauzketa eta kalitatearen ebaluazioa, alderantzizko transkripzioa eta qPCR hiru urrats ditu, urrats bakoitzak neurri asko ditu, zehatz-mehatz aurkeztuko dugu jarraian.

Ⅰ.ARNaren kalitatearen ebaluazioa

RT-qPCR esperimentuan, RNA erauzketa amaitu ondoren, RNAren kalitatea ebaluatu behar da, eta jarraipen-esperimentua sailkatu ondoren bakarrik egin daiteke.Ebaluazio metodoen artean espektrofotometroa, Agilent gel elektroforesia, Agilent 2100 analisia daude, horien artean gehien erabiltzen den espektrofotometroa eta agarosa gel elektroforesi metodoa detektatzeko.Kontuan izan behar da bi metodo hauek batera erabili behar direla RNAren kontzentrazioa, purutasuna eta osotasuna detektatzeko eta aztertzeko, RNAren kalitatea bermatzeko.

Erlazionatutako RNA isolatzeko kit: 

Zelula Guztira RNA isolatzeko kit

Oso araztua eta kalitate handiko RNA totala hainbat hazitako zeluletatik lor daiteke 11 minututan.

Animalien RNA osoa isolatzeko kit

Apurtasun handiko eta kalitate handiko RNA osoa erauzi azkar eta eraginkortasunez animalia-ehun ezberdinetatik.

Espektrofotometroa:

Espektrofotometroa RNAren kontzentrazioa eta purutasuna zehazteko erabiltzen da batez ere, baina ezin du RNAren eta hondakin genomikoaren osotasuna detektatu.Horien artean, A260/280 eta A260/230 parametro garrantzitsuak dira ARNaren purutasuna detektatzeko, eta ARNaren purutasuna haien balioen gorabeheraren arabera detekta daiteke:

1. 1.9< A260/280< 2.1, ARNaren purutasuna ona dela adieraziz;A260/280<1,9, RNAn proteina-hondarrak egon daitezkeela adieraziz;A260/280>2.1, RNAren degradazio partziala posiblea adierazten duena, agarosa gelaren elektroforesiaren bidez gehiago baieztatu daitekeena.

2. 2.0< A260/230< 2.2, ARNaren purutasuna ona dela adieraziz;A260/230< 2.0, RNAn erreaktibo organikoen hondakinak egon daitezkeela adieraziz, hala nola, fenolak, etanola edo azukreak.

Agarosa gel elektroforesia:

Agarosa gel elektroforesiaren saiakuntzak RNAren osotasuna, genoma eta proteina-hondarrak azter ditzake, baina ezin du RNAren kontzentrazioa zehaztasunez kuantifikatu edo erreaktibo organikoen hondakinak detektatu.Hartu adibidez RNA eukariotoen txantiloiak:

1. RNAri agarosa gel elektroforesia egin zitzaion.Gelaren mapan 28sRNA, 18sRNA eta 5.8sRNAren hiru banda bakar bakarrik bazeuden, ateratako RNA osorik dagoela adierazten du.Arrastatze-fenomeno bat badago, RNAren degradazio partziala adierazten du.

2. Kola-zuloaren eta 28sRNA bandaren artean banda distiratsu bakarra badago, DNA genomikoaren hondakina egon daiteke.

3. Kola-zuloan bandak agertzen badira, proteina eta beste substantzia makromolekularren hondakinak egon daitezkeela adierazten du.

Ⅱ. Alderantzizko transkripzioa

RNA erauzketa amaitu ondoren, cDNA bihurtu behar da ondorengo esperimentuetarako, beraz, alderantzikatzeko urratsa ezinbestekoa da.Alderantzizko transkripzioa alderantzizko transkriptasa eta primer hautapenetik sartuko da:

Alderantzizko transkriptasa hautatzea:

Alderantzizko transkriptasa tipikoak AMV RTase eta MMLV RTase dira.AMV RTase-ren RNasa H-ak jarduera handia du, sintesiaren luzera laburra, sintesi kopuru txikia eta egonkortasun termiko ona (42 ~ 55 ℃).MMLV RTasaren RNasa H jarduera ahula da, sintesiaren luzera luzea, sintesi kopurua handia eta egonkortasun termikoa eskasa (37 ~ 42 ℃).

RNasa H entzimak RNA txantiloia degradatzeko funtzioa duenez, RNasa H aktibitate ahula duen MMLV alderantzizko transkripzioan hautatu behar da lehentasunez, eta geroago ingeniaritza genetikoa egin ondoren, MMLVren egonkortasun termikoa jauzi kualitatiboa lortu du.Foregene hartuzForeasy Reverse Transcriptase (M-MLV alderantzizko transkripziorako) adibide gisa, birkonbinazio genetikoko teknologia erabiliz E. coli ingeniaritutako bakterioetan adierazitako alderantzizko transkriptasa berria da.DNA polimerasa birkonbinatzailea da, kate bakarreko RNA, DNA edo RNA:DNA hibrido batetik DNA kate osagarri bat sintetizatzen duena.Ez du RNasa H aktibitaterik, egonkortasun handia, RNA afinitate handia eta detekzio sentsibilitate handia.

 

Foreasy Reverse Transcriptase (M-MLV alderantzizko transkripziorako)

Primer hautaketa:

Orokorrean RT abiarazleak hiru kategoriatan banatzen dira: oligo dT, ausazko abiarazleak eta gene-hastapen espezifikoak.Aukeratu lehengai egokiak eskakizun esperimental ezberdinen arabera erabiltzeko.

1. Txantiloia jatorri eukariotikoa bada eta cDNA berantiarra erabiltzen bada ohiko PCR anplifikaziorako, Oligo (dT) gomendatzen da;Ondorengo esperimentua qPCRrako soilik erabiltzen bada, Oligo (dT) ausazko abiarazteekin nahastea gomendatzen da, alderantzizko transkripzioaren eraginkortasuna hobetzeko.

2. Txantiloia prokariotoetakoa bada, Random Primerak edo gene espezifikoak hautatu behar dira alderantzizko transkripzioa egiteko.

Ⅲ.qPCR

Fluoreszentzia kuantifikazioa metodo kuantitatiboen, lehen diseinuaren printzipioen, ROX hautapenaren, erreakzio-sistemaren konfigurazio eta erreakzio-baldintzen ezarpenetik, etab.

Metodo kuantitatiboen hautaketa:

Metodo kuantitatiboak metodo kuantitatibo erlatiboetan eta metodo kuantitatibo absolutuetan banatzen dira.Kuantifikazio erlatiboa tratamendu-metodo jakin batzuek gene-adierazpenean duten eragina detektatzeko, gene-adierazpenaren aldea une desberdinetan detektatzeko eta ehun desberdinetako gene-adierazpenaren aldea konparatzeko erabil daiteke.Kuantifikazio absolutuak birusaren azido nukleiko kopurua eta abar hauteman dezake.Esperimentuak egiterakoan, metodo kuantitatibo egokiak aukeratu behar ditugu gure esperimentuen arabera.

Lehen diseinuaren printzipioak:

qPCR-rako primeraren diseinua anplifikazio-eraginkortasunarekin eta produktuaren espezifikotasunarekin zuzenean lotuta dago.Hori dela eta, inprimagailu onak zuzen diseinatzea da qPCR arrakastatsuaren lehen urratsa.Primeraren diseinuan, printzipio hauei erreparatu behar zaie ohiko lehen diseinuaren printzipioa betetzen denean:

1. Helburu zatiaren luzera 100 eta 300 bp artean kontrolatzen da;

2. Exoien arteko diseinua DNA genomikoaren eragina saihesteko;

3. Diseinatutako abiarazleak anplifikazio-eraginkortasuna probatu behar dira, eta anplifikazio-eraginkortasuna estandarrera iristen denean (% 90-110) soilik erabili ahal izango dira esperimentu kuantitatiboetarako;

4. Primer kontzentrazioa 0,1uM eta 1,0uM artean optimizatu ohi da.

-ren hautaketaROX:

Erreakzio kuantitatiboaren prozesuan, ROX-ek bide optikoko diferentzia, pipetatze-errorea edo lurrunketa eta kondentsazioak eragindako bolumen-aldea modu uniformean doi ditzake, emaitzen errepikakortasuna hobetuz.Hala ere, kontuan izan behar da ROX aukeraketa tresnarekin lotuta dagoela.qPCR tresnak zuloen arteko aldea automatikoki zuzentzeko funtzioa badu, ez du ROX gehitu beharrik;bestela, ROX zuzenketa gehitu behar du.Erreaktiboak erosteko bazkide txikiek erabilitako tresnaren arabera egon behar dute ROX egokia aukeratzeko, geroago akatsak saihestu.

Erreakzio-sistemaren prestaketa:

20ul eta 50ul-ko erreakzio-bolumenak hobesten dira.Sistema formulatzen denean, honako gai hauei erreparatu behar zaie:

1. Erreakzio-sistema ultra-garbia laneko mahaian aireztapenaren bidez prestatu behar da, ddH berria₂Esperimentu bakoitzean O erabiltzen da;

2. Esperimentu bakoitzak NTC prestatu behar du sisteman kutsadurarik dagoen ala ez egiaztatzeko, eta primer pare bakoitzak NTC egin behar du sistema prestatzerakoan;

3. RNA txantiloian gDNA hondakinik dagoen ala ez detektatzeko, NRT presta daiteke detektatzeko lagin bakoitzeko;

4. Sistema prestatzerakoan, lagin baterako gutxienez 3 errepikapen tekniko egitea gomendatzen da;

5. Txantiloia cDNA denean, 5-10 aldiz diluitzea gomendatzen da qPCR esperimentuan alderantzizko transkripzio sistemaren inhibizio efektua murrizteko.Hobe da txantiloiaren kantitatea gradientearen arabera arakatzea, CT balioa 20-30 artean egon dadin;

6. Zehaztu behar den erreakzio kopurua, handitu % 5-10ean erreakzio kopuruaren arabera eta kalkulatu bolumenaren konfigurazio-zenbakia;

7, sistema aurrenahasketa printzipioa erabiliz prestatzen da, zentrifugazioaren ondoren nahastuz eta burbuilarik ez dagoela ziurtatzen du;

8, Ahal den neurrian, euskarri kontsumigarriak aukeratzea.

Erlazionatutako RT-qPCR Kit