Detektatzeko espezifikotasuna
Kasu gehienetan, primer diseinuaren helburua PCRren espezifikotasuna maximizatzea da.Hau aldagai askoren eragin gutxi-asko aurreikustearen arabera zehazten da.Aldagai garrantzitsu bat abiaraztearen 3′muturrean dagoen sekuentzia da.
Garrantzitsua da, espezifikotasunerako diseinatutako PCR saiakuntzak eraginkortasun handia mantentzea sorta dinamiko zabal batean, saiakuntzak ez baitu anplifikazio produktu ez-espezifikoa sortzen, eta, ondorioz, PCR erreaktiboekin lehiatzen dira edo anplifikazio erreakzio nagusia inhibitzen dute.
Jakina, kasu batzuetan, espezifikotasuna ez da garrantzitsuena, adibidez, helburua estuki erlazionatuta baina patogeno desberdinak kuantifikatzea denean, diseinu, optimizazio eta egiaztapen estandar bereziak behar dira.
Urtze-kurba anplikoien espezifikotasuna ebaluatzeko metodo estandarra da, helburu bakarra anplifikatu behar den ala ez behintzat.Hala ere, azpimarratu behar da urtze-kurbak engainagarriak izan daitezkeela, adibidez, abiarazte optimoen eta txantiloi-kontzentrazio baxuen efektu konbinatuen eraginpean egon daitezkeelako.
P5 |Urtze-kurbak bi xede-DNAren kantitate ezberdinen bi detektatzetik lortutako Tm-aldaketak erakusten ditu.
A. Kontzentrazio handiagoetan (ad)), qPCR neurketa amaitu ondoren ez dago primer dimero nabaririk.Txantiloiaren kontzentrazioa 50 kopiara jaisten den heinean (e), produktu ez-espezifikoa agertzen hasten da eta kontzentrazio txikieneko produktu bakarra bihurtzen da (f).
B. Probak Tms berdinak erregistratu zituen helburuko kontzentrazio guztietan, eta ez zegoen ageriko primer dimerorik kontzentrazio txikienean ere (5 kopia).Bi detekzio-metodo hauek erabiltzean, ez zen anplifikazio-produkturik detektatu NTCetan.
P5-k txantiloia kontzentrazio ezberdinetan dagoen laginekin lortutako disoluzio-kurbak erakusten ditu.P 5a-k erakusten du bi kontzentrazio baxuenetan, ekoitzitako anplifikazio-produktu ez-espezifikoen Tm-ak anplikoi espezifikoenak baino txikiagoak direla.
Jakina, detekzio-metodo hau ezin da fidagarritasunez erabili kontzentrazio baxuetan dauden helburuak detektatzeko.
Interesgarria da NTCek, hau da, DNArik ez duten laginek, ez zuten anplifikazio produkturik (ez-espezifikoa) erregistratu, hondoko DNA genomikoak anplifikazio/polimerizazio ez-espezifikoan parte har dezakeela adieraziz.
Batzuetan, horrelako hondoko abiarazleak eta anplifikazio ez-espezifikoa ezin dira konpondu, baina askotan posible da edozein txantiloi-kontzentraziotan eta NTC-n anplifikazio ez-espezifikoa ez duen detekzio-metodo bat diseinatzea (P 5b).
Hemen, xede-kontzentrazioaren anplifikazioa 35eko Cq batekin grabatuz gero, disoluzio-kurba zehatz bat sortuko da.Era berean, NTCek ez zuten anplifikazio ez-espezifikoaren zantzurik erakutsi.Batzuetan, detekzio-jokaera likore amaren menpekoa izan daiteke, eta anplifikazio ez-espezifikoa baino ez da antzematen zenbait tampon-konposiziotan, Mg2+ kontzentrazio ezberdinekin erlazionatuta egon daitekeena.
Detekzio-egonkortasuna
Ta optimizatzea urrats erabilgarria da qPCR detektatzeko egiaztapen eta optimizazio enpirikorako prozesuan.Primer-multzoaren sendotasunaren adierazle zuzena ematen du Cq baxuena sortzen duen tenperatura (edo tenperatura-tartea) NTC-a anplifikatu gabe erakutsiz.
Sentsibilitatearen bi edo lauko aldea agian ez da garrantzitsua mRNA adierazpen handia duten pertsonentzat, baina diagnostiko-probetarako, emaitza positiboen eta faltsu negatiboen arteko aldea esan dezake.
qPCR primeren Ta propietateak asko alda daitezke.Proba batzuk ez dira oso sendoak, eta abiarazteen Ta balio optimoaren azpian egiten ez badira, azkar eroriko dira.
Garrantzitsua da detekzio mota hau mundu errealean arazoa izaten delako, eta baliteke laginaren garbitasuna, DNAren kontzentrazioa edo beste DNAren presentzia ezin hobea izatea.
Horrez gain, helburuko kopia-kopurua sorta zabalean alda daiteke, eta erreaktiboak, plastikozko tresnak edo tresnak proba konfiguratzerakoan erabiltzen direnen desberdinak izan daitezke.
P6|Tenperatura-gradienteak PCR detektatzeko sendotasun desberdina erakusten du.
A. Erabili Bioline-ren Sensifast SYBR mastermix (BIO-98050 katalogo-zenbakia) giza garuneko RNAtik prestatutako cDNA-n PCR egiteko.
B. Erabili Bio-Rad-en CFX qPCR tresna apalenoaren anplifikazio-mapa eta disoluzio-kurba erregistratzeko (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).
C. ACSBG1-en anplifikazio-grafia eta urtze-kurba (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
D. GFAPen anplifikazio-grafia eta disoluzio-kurba (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).
E. Cq-ak errekostitze-tenperatura desberdinetan grabatutakoak, 7C tenperatura-gradientean erregistratutako Cq-en aldea erakutsiz.
P 6-k desiragarri den proba baten emaitza tipikoa erakusten du, non qPCR 59C eta 67C arteko Tas gradiente bat erabiliz (P 6a) egin zen, giza garuneko hiru gene espezifikoetarako lehengaiak erabiliz.
Anplifikazio grafikoan ikus daiteke Opalin-en abiarazleak idealetatik urrun daudela, haien Ta tarte optimoa oso estua delako (6b irudia), hau da, Cq-ak oso barreiatuta daude, eta ondorioz Cq-ak beren Cqs Low optimoekin alderatzen dira nabarmen.
Detekzio-metodo hau ezegonkorra da eta anplifikazio optimoa ekar dezake.Hori dela eta, lehen pare hau birdiseinatu behar da.Horrez gain, urtze-kurbaren analisiak (txertaketak) erakusten du detekzio-metodo honen espezifikotasuna ere arazotsua izan daitekeela, Ta bakoitzaren urtze-kurba ezberdina delako.
P 6c-n erakusten den ACSBG1 detektatzeko metodoa goiko Opalin detektatzeko metodoa baino sendoagoa da, baina oraindik ere idealetik urrun dago, eta litekeena da hobetu daitekeela.
Hala ere, sendotasunaren eta espezifikotasunaren arteko beharrezko loturarik ez dagoela azpimarratzen dugu, detekzio-metodo honek sortutako disoluzio-kurbak Tas guztietan (txertaketa) gailur-balio bera erakusten duelako.
Bestalde, sendotasun-proba askoz toleranteagoa da, Tas sorta zabalean antzeko Cq-ak sortzen ditu, P 6d-n erakusten den GFAP proban bezala.
8 gradu Celsius tarte berean lortutako Cqs-en aldea 1 baino txikiagoa da, eta disoluzio-kurbak (txertaketak) tenperatura tarte horretan detektatzeko ezaugarriak berresten ditu.Aipatzekoa da kalkulatutako Tas eta benetako Ta barrutia oso desberdinak izan daitezkeela.
Ikertzaileei inprimagailu eraginkorrak diseinatzen laguntzeko diseinatutako jarraibide asko daude, gehienak aspaldiko arauetan oinarritutakoak eta arreta handia jarri zaie lehengaien 3′muturrei.Askotan gomendatzen da G edo C bat sartzea 3' muturrean eta bi G edo C oinarri (GC clamp), baina azken 5 oinarrietatik bi baino gehiago.
Praktikan, arau hauek ikertzaileak gidatu ditzakete, baina ez dira zertan zuzenak izan egoera guztietan.
P7 |Primeraren 3′muturrak eragin gutxi du espezifikotasunean edo eraginkortasunean.
A. Giza HIF-1α (NM_181054.2) genearen abiarazleen posizioa.
B. Erabili Agilent Brilliant III SYBR Green likore ama (600882 zk.) probako sei elementu handitzeko.
C. Anplifikazio grafikoa eta urtze-kurba Bio-Rad-en CFX qPCR tresnarekin eta 3′muturreko primerekin grabatuta.NTCak gorriz agertzen dira.
D. Proba-elementu bakoitzaren Cqs erregistroa
Adibidez, P 7-ko emaitza 3′amaieraren arauarekin kontraesanean dago.Diseinu guztiek emaitza berdinak ematen dituzte funtsean, NTCn anplifikazio ez-espezifikoa lortzen duten bi primer konbinazio baino ez dituzte.
Hala ere, ezin dugu GC kliparen eragina onartu, kasu honetan, A edo T gehienez 30 base gisa erabiltzeak ez baitu espezifikotasuna murrizten.
C probak, non F primer-a GGCC-n amaitzen den, Cq-ak NTC-etan erregistratu zituen, 30 amaieran sekuentzia hauek saihestu nahi zituela adieraziz.Azpimarratzen dugu abiarazte-bikote baten 3′mutur sekuentzia onena zehazteko modu bakarra abiarazle hautagai batzuk esperimentalki ebaluatzea dela.
Anplifikazio-eraginkortasuna
Garrantzitsua da, nahiz eta PCR detekzio ez-espezifikoa inoiz zehatz bihurtu, anplifikazio-eraginkortasuna hainbat modutan doitu eta maximizatu daiteke entzima, likore ama, gehigarriak eta ziklo-baldintzak aldatuz.
PCR detektatzeko eraginkortasuna ebaluatzeko, hobe da helburuko azido nukleikoaren 10 edo 5 aldiz serieko diluzioa erabiltzea, hau da, "kurba estandarraren metodoa".
Kurba estandar bat sortzeko PCR anplikoiak edo DNA sintetikoa diana erabiltzen badira, helburu hauen serieko diluzioak hondoko DNAren kantitate konstante batekin nahastu behar dira (adibidez, DNA genomikoa).
P8 |PCRren eraginkortasuna ebaluatzeko diluzio-kurba.
A. Erabili lehengaiak HIF-1erako: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA eta R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC eta Agilent-en Brilliant III SYBR Green mastermix (600882 katalogo-zenbakia) PCR eta urtze-kurbaren baldintzetarako.
B. 100 ng RNA alderantziz transkribatu, 2 aldiz diluitu eta serieko diluitutako cDNA laginak 5 aldiz diluitu ziren 1 ng giza DNA genomikoan.Urtze-kurba txertatuan agertzen da.
C. RT erreakzioa, diluzioa eta serieko diluzioa errepikatu ziren bigarren cDNA laginarentzat, eta emaitzak antzekoak izan ziren.
P 8k bi kurba estandar erakusten ditu, detekzio-metodo bera erabiliz bi cDNA lagin ezberdinetan, emaitza eraginkortasun bera da, %100 ingurukoa, eta R2 balioa ere antzekoa da, hau da, datu esperimentalen eta erregresio-lerroaren arteko egokitze-maila edo datuen Linealtasun-maila.
Bi kurba estandarrak konparagarriak dira, baina ez berdinak.Helburua zehaztasunez kuantifikatzea bada, kontuan izan behar da onartezina dela kopia-zenbakiaren kalkulua ematea ziurgabetasuna azaldu gabe.
P9 |Kurba estandar baten bidez kuantifikazioarekin lotutako ziurgabetasuna neurtzeko.
A. Erabili GAPDH-rako lehengaiak (NM_002046) PCR eta urtze-kurbaren baldintzak egiteko.F: ACAGTTGCCATGTAGACC eta R: TAACTGGTTGAGCACAGG eta Biolineren Sensifast SYBR mastermix (BIO-98050 katalogo-zenbakia).
B. Anplifikazio-diagrama, urtze-kurba eta kurba estandarra Bio-Rad-en CFX qPCR tresnarekin grabatuta.
C. Kurba estandarraren grafikoa eta % 95eko konfiantza-tartea (CI).
D. Diluzio-kurbatik eratorritako hiru Cq balioen kopia-zenbakia eta %95eko konfiantza-tartea.
P 9k erakusten du proba optimizatu baterako, kurba estandar bakar baten berezko aldakortasuna 2 aldiz gutxi gorabehera (% 95eko konfiantza-tartea, minimotik gehienez), espero daitekeen aldakortasun txikiena izan daitekeela.
Erlazionatutako produktua:
Animalia-ehunen Direct PCR kit
Argitalpenaren ordua: 2021-09-30
