Pipeta-puntak eta EP-hodiak, etab.
1. Prestatu % 0,1 (milaren bat) DEPC (substantzia oso toxikoa) ur deionizatuarekin, erabili kontu handiz kanpaia batean eta gorde 4°C-tan argitik urrun;
DEPC ura DEPC-rekin tratatutako ur purua da eta tenperatura eta presio handiko esterilizatuta.RNasa, DNasa eta proteinasarik gabekoa izateko probatua.
2. Jarri pipeta-punta eta EP hodia % 0,1eko DEPC-an, eta ziurtatu pipeta-punta eta EP hodia % 0,1eko DEP-arekin betetzen direla.
3. Babestu argitik, utzi gelditzen, gau osoan zehar (12-24 ordu)
4. Punta eta EP hodia dituen kutxa ez da DEPCn busti behar.Punta edo EP hodiko DEPC ura gutxi gorabehera kendu ondoren, bildu eta bildu.
5. 121 gradu Celsius, 30min
6. 180 gradu Celsius, hainbat orduz lehortu (gutxienez 3 ordu)
Oharra: a.Erabili latexezko eskularruak eta maskarak DEPC manipulatzean!b, edo DEPC esterilizaziorik gabe, 130 ℃, 90min autoklabea (laborategi askotan tenperatura altuko esterilizazioa bi aldiz)
RNA erauzteko gogoetak
Ehunen RNA isolatzearen porrotaren bi fenomeno nagusi
RNA degradazioa eta ehunetan ezpurutasunen hondakinak,degradazioari dagokionez, ikus dezagun lehenik eta behin hazkuntzako zeluletatik ateratako RNA zergatik ez den erraz degradatzen.Dauden RNA erauzteko erreaktiboek RNasa azkar inhibitzen duten osagaiak dituzte.Gehitu lisatua hazten diren zelulei, eta, besterik gabe, nahastu, zelula guztiak ondo nahas daitezke lisatuarekin, eta zelulak guztiz lisatzen dira.Zelulak lisatu ondoren, lisatuaren osagai aktiboek berehala inhibitzen dute zelula barneko RNasa, beraz, RNA oso-osorik geratzen da.Hau da, hazten diren zelulak lisatuarekin erraz eta guztiz kontaktuan daudenez, haien RNA ez da erraz degradatzen;bestalde, ehuneko RNA erraz degradatzen da, ehuneko zelulak ez direlako erraza lisatuarekin azkar harremanetan jartzea.kontaktu nahikoa dela eta.Beraz,RNAren jarduera inhibitzen duen bitartean ehuna zelula bakar batean bihurtzeko modu bat dagoela suposatuz, degradazioaren arazoa guztiz konpondu liteke.
Nitrogeno likidoa fresatzea da horrelako metodorik eraginkorrena.Hala ere, nitrogeno likidoa fresatzeko metodoa oso zaila da, batez ere lagin kopurua handia denean.Honek hurrengo gauzarik onena sortu zuen: homogeneizatzailea.Thehomogeneizatzaileametodoak ez du kontuan hartzen RNasaren jarduera nola inhibitzen den zelulak lisatuarekin harremanetan jarri aurretik, baizik eta ehunen haustura-tasa zelula barneko RNasak RN degradatzen duen abiadura baino azkarragoa dela erregutzen du.
Homogeneizatzaile elektrikoaren eragina hobea da,eta beira homogeneizatzailearen eragina eskasa da, baina, oro har, homogeneizatzaile metodoak ezin du degradazio-fenomenoa saihestu.Horregatik, erauzketa degradatzen bada, jatorrizko homogeneizatzaile elektrikoa erabili behar da nitrogeno likidoarekin ehotzeko;jatorrizko beira-homogeneizatzailea homogeneizatzaile elektriko batera aldatu behar da edo zuzenean nitrogeno likidoarekin fresatu behar da.Arazoa ia %100 bideragarria da.konpondu.
Ondorengo esperimentuei eragiten dien ezpurutasun-hondarren arazoak degradazioa baino arrazoi anitzagoak ditu, eta irtenbideak desberdinak dira.Laburbilduz,ehunean degradazioa edo hondakin-ezpurutasunak badaude, material esperimental zehatzaren erauzketa-metodoa/erreaktiboa optimizatu behar da.Ez duzu zure lagin preziatuak optimizatzeko erabili behar: arraina/oilaskoa bezalako animalia txiki batzuk eros ditzakezu merkatuan, dagokion materialaren zatia hartu RNA erauzteko, eta beste zatia proteinak erauzteko – ahoa, urdaila eta hesteekin xehatu.
Erauzitako RNAren xede-ARNa jarraipen-esperimentu desberdinetarako erabiltzen da, eta bere kalitate-eskakizunak desberdinak dira
cDNA liburutegiaren eraikuntzak RNAren osotasuna behar du entzimaren erreakzio inhibitzaileen hondakinik gabe;Northern RNA osotasun handiagoa eta entzimaren erreakzio inhibitzaileen hondakinen eskakizun txikiagoak behar dira;RT-PCR-k ez du RNA osotasun handiegia behar,baina erreakzio entzimatikoak inhibitzen ditu.Hondakinen baldintzak zorrotzak dira.Sarrerak zehazten du irteera;helburua garbitasun handieneko RNA lortzea den bakoitzean, jendeari eta dirua kostatuko zaio.
Laginak biltzea/biltegiratzea
Degradazioan eragiten duten faktoreak Laginak gorputz bizia/edo jatorrizko hazkuntza-ingurunetik irten ondoren, lagineko entzima endogenoak RNA degradatzen hasiko dira,eta degradazio-tasa entzima endogenoen edukiarekin eta tenperaturarekin lotuta dago.Tradizionalki, bi modu baino ez daude entzima endogenoaren jarduera guztiz inhibitzeko: lisatua berehala gehitu eta homogeneizatu sakon eta azkar;zati txikitan moztu eta berehala izoztu nitrogeno likidoan.Bi ikuspegiek funtzionamendu azkarra behar dute.Bigarrena lagin guztietarako egokia da, lehena, berriz, zelulen eta entzima endogenoen eduki txikia duten eta homogeneizatzeko errazagoa den ehunetarako soilik.Zehazki, landare-ehuna, gibela, timoa, pankrea, barea, garuna, koipea, gihar-ehuna eta abar nitrogeno likidoarekin izoztu behar dira aurrera jarraitu aurretik.
Laginen zatiketa eta homogeneizazioa
Degradazioan eta errendimenduan eragina duten faktoreak Laginaren zatiketa dasakon homogeneizatzeko, hau da, RNA osoa eta osoa askatzeko.Zelulak zuzenean homogeneizatu daitezke hautsi gabe.Ehunak hautsi ondoren bakarrik homogeneizatu daitezke.Legamiak eta bakterioak dagozkien entzimekin hautsi behar dira homogeneizatu aurretik.Entzima endogeno-eduki txikiagoa duten eta homogeneizazio errazagoa duten ehunak birrindu eta homogeneizatu daitezke aldi berean lisatuan homogeneizatzaile baten bidez;Landare-ehuna, gibela, timoa, pankrea, barea, garuna, koipea, gihar-ehuna eta beste lagin batzuk, Entzima endogenoetan asko dira edo ez dira erraz homogeneizatzen,beraz, ehunen haustura eta homogeneizazioa bereizita egin behar dira.Zatikatze metodo fidagarriena eta produktiboena nitrogeno likidoarekin fresatzea da, eta homogeneizatzeko metodo fidagarriena homogeneizatzaile elektrikoa erabiltzea da.Ohar berezi bat nitrogeno likidoarekin fresatzeari buruz: lagina ez da desizoztu behar fresaketa-prozesu osoan zehar, izoztuta daudenean entzima endogenoek funtzionatzeko aukera gehiago baitute.
Lisatua aukeratzea
Funtzionamenduaren erosotasunari eta hondar ezpurutasun endogenoen faktoreei eraginez Erabiltzen diren lisi-soluzioek RNasaren jarduera ia galarazi dezakete.Hori dela eta, lisi-soluzio bat aukeratzeko funtsezko puntua arazketa metodoarekin batera hartzea da.Salbuespen bat dago:entzima endogeno-eduki handia duten laginek fenola duen lisatu bat erabiltzea gomendatzen da, entzima endogenoak inaktibatzeko gaitasuna areagotzeko.
Arazketa metodoa aukeratzea
Hondar-ezpurutasun endogenoei eragiten dieten faktoreak, erauzketa-abiadura Lagin garbietarako, esate baterako, zelulak, emaitza onak lor daitezke esku artean dagoen ia edozein arazte-metodorekin.Baina beste lagin askorentzat, batez ere ezpurutasun-maila handia dutenentzat, hala nola landareak, gibela, bakterioak, etab., ezinbestekoa da arazketa-metodo egoki bat aukeratzea.Zutabe zentrifugoen arazketa-metodoak erauzketa-abiadura azkarra du eta RNAren ondorengo erreakzio entzimatikoari eragiten dioten ezpurutasunak eraginkortasunez ken ditzake, baina garestia da (Foregene-k kit errentagarriak eskain ditzake, xehetasun gehiago egin klikhemen);Purifikazio metodo ekonomiko eta klasikoak erabiliz, LiCl prezipitazioa adibidez, emaitza onak lor ditzakete, baina eragiketa denbora luzea da..
"Hiru diziplina eta zortzi arreta" RNA erauzketarako
1. diziplina:Amaitzea entzima exogenoen kutsadurari.
1. oharra:Erabili zorrozki maskarak eta eskularruak.
2. oharra:Zentrifugatzaile-hodiak, Punta-buruak, pipeta-barrak, elektroforesi-tangak eta esperimentuan parte hartzen duten banku esperimentalak ondo bota behar dira.
3. oharra:Esperimentuan parte hartzen duten erreaktibo/disoluzioek, batez ere ura, RNasik gabekoak izan behar dute.
2. diziplina:Entzima endogenoen jarduera blokeatu
4. oharra:Aukeratu homogeneizazio metodo egokia.
5. oharra:Aukeratu lisatu egokia.
6. oharra:Kontrolatu laginaren hasierako kantitatea.
3. diziplina:Argitu zure erauzketa helburua
7. oharra:Edozein lisatu-sistema laginaren hasierako gehienezko kopurura hurbiltzen denean, erauzketa arrakasta-tasa nabarmen jaisten da.
8. oharra:RNA ateratzeko arrakastaren irizpide ekonomiko bakarra ondorengo esperimentuetan arrakasta izatea da, ez etekina.
RNasaren kutsaduraren 10 iturri nagusiak
1. Hatzak entzima exogenoen lehen iturria dira, beraz, eskularruak maiz jantzi eta ordezkatu behar dira.Horrez gain, maskarak ere eraman behar dira, arnasketa ere entzimen iturri garrantzitsua baita.Eskularru-maskara janztearen abantaila gehigarri bat esperimentatzailea babestea da.
2. Pipeta-puntak, zentrifuga-hodiak, pipetak - RNasa ezin da esterilizazioaren bidez bakarrik desaktibatu, beraz, pipeta-puntak eta zentrifuga-hodiak DEPCrekin tratatu behar dira, DEPC tratatu gisa markatuta egon arren.Hobe da erabilera bereziko pipeta erabiltzea, garbitu %75eko alkoholdun kotoi-bola batekin erabili aurretik, batez ere hagatxoa;horrez gain, ziurtatu ez duzula buru kentzailerik erabili.
3. Urak/bufferak RNasen kutsadurarik gabe egon behar du.
4. Proba mahaia gutxienez %75eko alkoholdun kotoizko bolekin garbitu behar da.
5.RNasa endogenoa Ehun guztiek entzima endogenoak dituzte, beraz, nitrogeno likidoarekin ehunak azkar izoztea da degradazioa murrizteko modurik onena.Nitrogeno likidoa biltegiratzeko/ehotzeko metodoa deserosoa da, baina modu bakarra da entzima endogenoen maila altua duten ehunentzat.
6. RNA laginak RNA erauzteko produktuek RNasaren kutsaduraren arrastoak izan ditzakete.
7. Plasmidoen erauzketa Plasmidoen erauzketa askotan Rnasa erabiltzen da RNA degradatzeko, eta hondar Rnasa K Proteinasarekin digeritu eta PCI bidez atera behar da.
8. RNA biltegiratzea Tenperatura baxuan gordetzen bada ere, RNasaren arrastoek RNA degradazioa eragingo dute.RNA epe luzerako kontserbatzeko irtenbiderik onena gatza/alkohol suspentsioa da, alkoholak tenperatura baxuetan jarduera entzimatiko guztiak inhibitzen dituelako.
9. Katioiek (Ca, Mg) ioi hauek dituztenean, 5 minutuz 80C-tan berotzeak RNA zatitzea eragingo du, beraz, RNA berotu behar bada, kontserbazio-soluzioak agente kelatzaile bat eduki behar du (1 mM sodio zitratoa, pH 6,4).
10. Ondorengo esperimentuetan erabilitako entzimak RNasak kutsatuta egon daitezke.
RNA erauzteko 10 aholku
1: azkar saihestu RNasen jarduera.Laginak azkar izozten dira bildu ondoren, eta RNasa eragiketa azkarrean desaktibatzen da lisian zehar.
2: Aukeratu erauzketa-metodo egoki bat erribozima-eduki handia duten ehunetarako, eta ehun adiposoa fenola duen metodoa erabiltzea da onena.
3: Iragarpen-kalitateak Northern eskatzen du, cDNA liburutegien eraikuntzak osotasun handia behar du eta RT-PCR eta RPA (Ribonuklease babesteko saiakuntza) ez dute osotasun handirik behar.RT-PCR-k garbitasun handia behar du (entzima inhibitzaileen hondakinak).
4: Homogeneizazioa sakona da etekina hobetzeko eta degradazioa murrizteko gakoa.
5: Egiaztatu RNA elektroforesiaren detekzioaren osotasuna, 28S: 18S = 2: 1 zeinu osoa da, 1: 1 ere onargarria da esperimentu gehienetarako.
6: DNA kentzea RT-PCRrako, array-analisia Hobe da DNA kentzeko I Dnasa erabiltzea.
7: Murriztu entzima exogenoen kutsadura - entzimak ezin dira kanpotik inportatu.
8: Kontzentrazio baxuko azido nukleikoa kontzentratzen denean, prezipitazio-erreaktibo bat gehitu behar da.Baina entzimak eta DNA kutsatzea saihesteko.
9: RNA ondo disolbatu, behar izanez gero, berotu 65C-tan 5 minutuz.
biltegiratzeko metodo egokia
–20C-tan gorde daiteke denbora laburrean, eta –80C-tan denbora luzez.RNA etekinak hobetzeko lehen urratsa lagin ezberdinen RNA edukia asko aldatzen dela konturatzea da.Ugaritasun handia (2-4ug/mg), hala nola gibela, pankrea, bihotza, ugaritasun ertaina (0,05-2ug/mg), hala nola garuna, enbrioia, giltzurruna, birika, timoa, obulutegia, ugaritasun txikia (<0,05ug/mg) mg), hala nola maskuria, hezurra, koipea.
1: Lisi zelulak RN askatzeko - RNA askatzen ez bada, etekina murriztuko da.Homogeneizazio elektrikoak beste homogeneizazio metodo batzuek baino hobeto funtzionatzen du, baina baliteke beste metodo batzuekin ere konbinatu behar izatea, hala nola nitrogeno likidoaren birrintzea, digestio entzimatikoa (Lisozima/Litikasa)
2: Erauzketa metodoaren optimizazioa.Fenoletan oinarritutako metodoen arazo handiena estratifikazio osatugabea eta RNA galera partziala dira (gainekoa ezin da guztiz kendu).Estratifikazio osoa azido nukleiko eta proteina-eduki handiari zor zaio, eta erabilitako lisatu kopurua handituz edo lagin kopurua murriztuz konpondu daiteke.Kloroformoaren erauzketa-urrats bat gehitu zitzaion ehun adiposoari.RNA galera atzera-ponpatuz edo geruza organikoa kenduz gero, zentrifugazioaz murriztu daiteke.Zutabeen zentrifugazioan oinarritutako metodoen arazo handiena gehiegizko lagina da.
Erauzketarako aholku klasikoak
1. Fenolaren arazketa: Gehitu 1:1 Fenol/Kloroformo bolumen berdina eta nahastu indarrez 1-2 minutuz.Zentrifugatu abiadura handian 2 minutuz.Kontu handiz kendu gainditzailea (%80-90).Inoiz ez erdiko geruzara iritsi.Erreakzio-disoluzioaren bolumen berdina Fenol/Kloroformoari gehi dakioke eta gainnatzailea kendu.Bi gainnatzaileak elkarrekin nahas daitezke azido nukleikoen prezipitaziorako, etekina hobetzeko.Ez izan leunegi nahasterakoan, eta ez saiatu gaindiko guztia kentzen.
2. Garbiketa % 70-80 etanolarekin: Garbiketan zehar, azido nukleikoa eseki behar da, hondar gatza garbitzen dela ziurtatzeko.Aldi berean, etanola bota eta berehala, zentrifugatu abiadura handian segundo batzuetan, eta gero kendu hondar-etanola pipeta batekin.Disolbatu giro-tenperaturan 5-10 minutuz egon ondoren.
11. Erakunde berezien erauzketa
1. Zuntz-ehuna: bihotza/eskeleto-muskulua bezalako zuntz-ehunetatik ARNa ateratzeko gakoa ehuna guztiz haustea da.Ehun hauek zelula-dentsitate baxua dute, beraz, ehunen pisu-unitate bakoitzeko RNA-kopurua txikia da, eta hobe da ahalik eta hasierako kopuru gehien erabiltzea.Ziurtatu ehuna ondo ehotzen duzula izozte-baldintzetan.
2. Proteina/gantz-eduki handia duten ehunak: garuneko/landarezko gantz edukia handia da.PCI erauzketaren ondoren, gainditzaileak flokula zuriak ditu.Gaingaia kloroformoarekin berriro atera behar da.
3. Azido nukleiko/erribozima eduki handia duten ehunak: bazeak/timoak azido nukleiko eta erribozima eduki handia dauka.Ehuna izozte-baldintzetan ehotzeak eta ondoren homogeneizazio azkarrak erribozimak eraginkortasunez desaktibatu ditzake.Hala ere, lisatua likatsuegia bada (azido nukleikoen eduki handia dela eta), PCI erauzketa ezin izango da eraginkortasunez estratifikatu;lisato gehiago gehitzeak arazo hau konpondu dezake.PCI erauzketa anitzek hondar DNA gehiago ken dezakete.Alkohola gehitu eta berehala prezipitazio zuri bat sortzen bada, DNA kutsatuta dagoela adierazten du.Desegin ondoren PCI azidoarekin berriro erauzteak DNAren kutsadura ken dezake.
4. Landare-ehuna: Landare-ehuna animalia-ehuna baino konplexuagoa da.Orokorrean, landareak nitrogeno likidoaren baldintzetan ehotzen dira, beraz, ez da ohikoa entzima endogenoek RNA degradatzea.Degradazio-arazoa konpontzen ez bada, ia ziur laginak dituen ezpurutasunek eragiten dute.Landare askotan dauden ezpurutasunek hondarrak ekarriko dituzte, eta hondakinen arrazoia askotan ezpurutasun horiek ARNrekin antzekotasun batzuk dituztelako izaten da: zuk hauspeatzen duzu eta nik hauspeatzen duzu, eta zuk xurgatzen duzu eta nik xurgatzen dut.Ezaugarri horiek zehazten dute entzima inhibitzaile oso indartsuak direla.
Gaur egun, RNA erauzteko erreaktibo komertzialak animalia-ehun ia guztietara molda daitezke doikuntza txikiekin, baina landare-ehun gehienetarako egokiak izan daitezkeen RNA erauzteko erreaktibo komertzialak gutxi daude.Zorionez, Foregene-k berezia eman dezakelandareen RNA erauzteko kitak, daukaguLandare Guztira RNA isolatzeko kit, Landare Guztira RNA isolatzeko kit Plus.Azken hau polisakarido eta polifenol eduki handia duten landareentzat bereziki diseinatuta dago.RNA erauzketarako, laborategiko erabiltzaileen iritzia bereziki ona da.
12. Lagina izoztearen eta desizotzearen eragina Izoztutako lagina handiagoa izan daiteke, eta moztu egin behar da RNA erauzteko erabili aurretik.Laginak mozketan urtu ohi dira (agian partzialki).Baliteke izoztutako laginak pisatu behar izatea RNA atera aurretik, eta prozesu honetan desizoztea izango da, zalantzarik gabe.Batzuetan, laginaren desizoztea ere gertatzen da nitrogeno likidoaren fresaketa prozesuan;edo izoztutako lagina zuzenean gehitzen zaio lisatuari nitrogeno likidoa fresatu gabe, eta erabateko homogeneizazioa baino lehen desizoztea gertatuko da.Esperimentuek frogatu dute izoztutako ehunak desizoztean RNA degradatzeko joera handiagoa duela ehun freskoak baino.Litekeena den arrazoia: izozte-desizozte prozesuak zelulen barruko egiturak apurtzen ditu, entzima endogenoak RNArekin zuzenean harremanetan jartzea erraztuz.
13. ARNaren kalitatearen epaiketa Normalean, elektroforesia erabiltzen da RNAren osotasuna epaitzeko, eta A260/A280 erabiltzen da RNAren purutasuna epaitzeko.Teorian, RNA osoak 28S:18S = 2,7:1 erlazioa du, eta datu gehienek 28S:18S = 2:1 ratioa azpimarratzen dute.Kontua da laginetatik ateratako ARN ia bat ere ez dagoela 2:1 proportzioan (Agilent Bioanalyzer erabiliz lortu da).
RNAren elektroforesiaren emaitzek faktore askok eragiten dute, besteak beste, egitura sekundarioa, elektroforesiaren baldintzak, laginaren karga, EBren saturazio-maila, etab. Erabili elektroforesi natiboa RNA detektatzeko eta DNA Markatzailea kontrol gisa erabili.28S 2kb-ko eta 18S 0,9kb-ko argiak badira, eta 28S: 18S > 1, osotasunak ondorengo esperimentu gehienen baldintzak bete ditzake.
A260/A280 nahasmen handia eragin duen adierazlea da.Lehenik eta behin, argitu behar da adierazle honen jatorrizko esanahia azido nukleikoetarako: RNA purua, bere A260/280 = 2,0 inguru.RNA purua 'kausa' da eta A260/A280 = 2 'efektua' da.Orain denek A260/A280 "kausa" gisa erabiltzen ari dira, "A260/A280 = 2 baldin bada, RNA hutsa da" pentsatzen dutela, eta horrek nahasmena dakar.
Interesatzen bazaizu, erauzketan erabili ohi den erreaktibo txiki bat gehi diezaiokezu, hala nola, fenola, guanidina isotiozianatoa, PEG, etab., zure RNA laginari, eta ondoren neurtu A260/A280 erlazioa.Errealitatea da RNA erauzteko erabiltzen diren erreaktibo askok, baita laginean dauden ezpurutasun askok ere, A260 eta A280 inguruan xurgatzen dutela, eta A260/A280 eraginez.
Gaur egungo ikuspegi hezigarriena RNA laginak 200-300 nm tartean eskaneatzea da.RNA puruaren kurbak ezaugarri hauek ditu: kurba leuna da, A230 eta A260 bi inflexio puntu dira, A300 0tik gertu dago, A260/A280 = 2,0 inguru eta A260/A230 = 2,0 inguru.Eskaneatutako datuak eskuragarri ez badira, A260/A230 erlazioa ere zehaztu behar da, proportzio hori sentikorragoa baita erreakzio entzimatikoan eragiten duten ezpurutasun guztiak garraiatzeko.Kontuan izan gailuaren barruti lineala (0,1-0,5 A260rako).
Beste bi fenomeno baliagarri daude: ratioa 0,3 inguru txikiagoa izango da A260/A280 uretan neurtzen denean;10 mM EDTAn neurtutako ratioa, berriz, 1 mM EDTAn neurtutakoa baino 0,2 handiagoa da.
Erlazionatutako produktuak:
Txinako Landare Guztira RNA isolatzeko kit fabrikatzailea eta hornitzailea |Foregene (foreivd.com)
RNA isolatzeko seriea - Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)
Argitalpenaren ordua: 2022-07-15
