Jakina da dogma zentralean RNA DNAren eta proteinen adierazpenaren arteko transkripzio-bitartekaria dela.DNAren detekzioarekin alderatuta, RNA detektatzeak modu objektiboagoan isla dezake organismoen geneen adierazpena.RNArekin zerikusia duten esperimentuak honako hauek dira: qRT-PCR, RNA-Seq eta fusio-geneen detekzioa, etab. RNAren beraren ezaugarrietan oinarrituta (RNAren azukre-eraztunak DNAren azukre-eraztunak baino hidroxilo talde aske gehiago du), inguruneko RNasa kopuru handiarekin batera, RNA ezegonkorragoa da eta errazago degradatzen da DNA.Zaborra sartu, zaborra kanpora, RNAren kalitatea ona ez bada, orduan emaitza esperimentalak ez dira onak izan behar, zehatz-mehatz datu okerrak edo errepikagarritasun eskasa bezala adierazita.Hori dela eta, arreta handiagoa jarri behar zaio RNAren prozesatzeari, eta kalitate-kontrolaren lotura ere garrantzitsuagoa da ondorengo datu esperimentalen zehaztasuna eta zehaztasuna bermatzeko.

RNAren kalitatea kontrolatzeko, normalean erabili ohi diren metodo hauek daude:

• Espektrofotometria
• agarosa gel elektroforesia
• Agilent Bioanalyzer
• denbora errealeko PCR fluoreszente kuantitatiboa
• Qubit koloratzaile fluoreszenteen metodoa

01 Espektrofotometria

RNAk lotura bikoitz konjokatuak ditu eta 260 nm-ko uhin-luzeran xurgatzeko gailurra du.Lambert-Beer-en legearen arabera, ARN kontzentrazioa 260nm-ko xurgapen-gailurretik kalkula dezakegu.Horrez gain, RNAren purutasuna ere kalkula dezakegu 260nm, 280nm eta 230nm-ko xurgapen-gailurren ratioaren arabera.280 nm eta 230 nm proteinen eta molekula txikien xurgapen gailurrak dira, hurrenez hurren.RNAren garbitasun kualifikatuaren A260/A280 eta A260/A230 erlazioak 2 baino handiagoa izan behar du. 2 baino txikiagoa bada, esan nahi du RNA laginean proteina edo molekula txikien kutsadura dagoela eta berriro araztu behar dela.Kutsadura iturriek beherako esperimentuetan eragina izango dute, hala nola, PCR erreakzioen anplifikazio-efizientzia inhibituz, emaitza kuantitatibo okerrak lortuz.RNAren purutasunak eragin handia du ondorengo emaitzetan, beraz, espektrofotometria, oro har, ezinbesteko kalitatea kontrolatzeko lotura da azido nukleikoen esperimentuetan lehen urratsean.

1. Irudia RNA/DNA xurgatze-espektro tipikoa

02 Agarosa gel elektroforesia

Garbitasunaz gain, RNAren osotasuna ere RNAren kalitatea epaitzeko adierazle garrantzitsuetako bat da.ARNaren degradazioak laginaren zati labur ugari ekarriko ditu, beraz, erreferentzia-sekuentziak eraginkortasunez detektatu eta estali daitezkeen RNA zatien kopurua murriztuko da.RNAren osotasuna % 1eko agarosa gel batean RNA osoaren elektroforesiaren bidez egiaztatu daiteke.Metodo honek gela zuk zeuk konfigura dezakezu edo E-Gel™ sistema aurrefabrikatua erabil dezakezu osotasuna probatzeko.RNA osoaren % 80 baino gehiago RNA erribosomikoa da, gehiengoa 28S eta 18S rRNAz osatuta (ugaztun-sistemetan).Kalitate oneko RNAk bi barra distiratsu bistakoak erakutsiko ditu, 28S eta 18S barra distiratsuak, hurrenez hurren, 5 Kb eta 2 Kb-tan, eta ratioa 2:1etik hurbil egon ohi da.Egoera difusoan badago, RNA lagina degradatu egin dela esan nahi du, eta gero deskribatutako metodoa erabiltzea gomendatzen da RNAren kalitatea gehiago probatzeko.

2. Irudia. Agarosa gel elektroforesian degradatutako (2. erreia) eta oso-osorik dagoen RNAren (3. erreia) konparazioa

03 Agilent Bioanalyzer

Goian deskribatutako agarosa gel elektroforesi metodoaz gain, RNAren osotasuna erraz eta azkar identifikatzen lagun diezagukeen, Agilent bioanalizatzailea ere erabil dezakegu RNAren osotasuna zehazteko.Mikrofluidika, elektroforesi kapilarra eta fluoreszentzia konbinazio bat erabiltzen du RNAren kontzentrazioa eta osotasuna ebaluatzeko.RNA laginaren profila aztertzeko integratutako algoritmoa erabiliz, Agilent bioanalizatzaileak erreferentziako RNAren osotasun-balioa kalkula dezake, RNAren osotasun-zenbakia (aurrerantzean RIN deitzen dena) [1].RIN-ren balioa zenbat eta handiagoa izan, orduan eta handiagoa izango da RNAren osotasuna (1 oso degradatua dago, 10 osatuena).RNArekin lotutako esperimentu batzuek RIN kalitatea ebaluatzeko parametro gisa erabiltzea proposatzen dute.Errendimendu handiko sekuentziazio esperimentuak (aurrerantzean NGS deitzen direnak) adibide gisa hartuta, Thermo Fisher-en Oncomine panel seriean B zelulen eta T zelulen antigenoaren errezeptoreak detektatzeko erabiltzen den Oncomine™ Human Immune Repertoire-ren jarraibideek iradokitzen dute RIN balioak 4 baino handiagoak dituzten laginak, irakurketa eta klon eraginkorragoak neurtu daitezkeela (3 irudia).Panel desberdinetarako gomendatutako barruti desberdinak daude, eta askotan RIN handiagoak datu eraginkorragoak ekar ditzake.

3. irudian, Oncomine™ Human Immun Repertoire esperimentuetan, RIN 4 baino handiagoa duten laginek irakurketa eraginkorragoak eta T zelulen klonak hauteman ditzakete.【2】

Hala ere, RIN balioak muga batzuk ere baditu.RIN NGS datu esperimentalen kalitatearekin korrelazio handia badu ere, ez da egokia FFPE laginetarako.FFPE laginak kimikoki tratatu dira denbora luzez, eta ateratako RNAk, oro har, RIN balio nahiko baxua du.Hala ere, horrek ez du esan nahi esperimentuaren datu eraginkorrak asegabeak izan behar direnik.FFPE laginen kalitatea zehaztasunez ebaluatzeko, RIN ez diren beste neurketak erabili behar ditugu.RIN-az gain, Agilent bioanalyzer-ek DV200 balioa ere kalkula dezake RNAren kalitatearen ebaluazio-parametro gisa.DV200 RNA lagin batean 200 bp baino handiagoak diren zatien proportzioa kalkulatzen duen parametroa da.DV200 FFPE laginaren kalitatearen adierazle hobea da RIN baino.FFPEk ateratako RNArentzat, oso korrelazio handia du eraginkortasunez detektatu daitezkeen gene-kopuruarekin eta gene-aniztasunarekin [3].DV200-k FFPEren kalitatea detektatzeko gabeziak konpon ditzakeen arren, Agilent bioanalizatzaileak oraindik ezin ditu RNA laginen kalitate-arazoak osotasunean aztertu, laginetan inhibitzaileak dauden ala ez barne.Inhibitzaileek beraiek beheranzko esperimentuen anplifikazio-eraginkortasunean eragin dezakete eta datu erabilgarriak murrizten dituzte.Laginean inhibitzailerik dagoen ala ez jakiteko, jarraian deskribatutako denbora errealeko fluoreszenteen metodo kuantitatiboa har dezakegu.

04 denbora errealeko PCR fluoreszente kuantitatiboa

Denbora errealeko PCR metodo kuantitatibo fluoreszenteak laginaren inhibitzaileak detektatu ez ezik, FFPE lagineko RNAren kalitatea zehaztasunez islatu ditzake.Agilent analizatzaile biologikoekin alderatuta, denbora errealeko fluoreszentzia tresna kuantitatiboak ezagunagoak dira laborategi biologiko nagusietan, aplikazio zabalagoa dutelako.RNA laginen kalitatea probatzeko, barne erreferentziako geneetarako primer-zundak erosi edo prestatu besterik ez ditugu egin behar, adibidez GUSB (Hs00939627 kat. zk.).Abiarazle, zunda eta estandar multzo hau (kontzentrazio ezagunaren RNA osoa) esperimentu kuantitatibo absolutuak egiteko erabiliz, RNA zatien kontzentrazio eraginkorra RNAren kalitatearen ebaluazio estandar gisa kalkula daiteke (Functional RNA Quantitation (FRQ) laburbilduz).NGS proba batean, RNA laginen FRQk datu-bolumen eraginkorrarekin oso korrelazio handia duela ikusi dugu.0,2 ng/uL FRQ baino handiagoa den lagin guztietarako, irakurketen % 70ek gutxienez erreferentzia-sekuentzia modu eraginkorrean estal dezakete (4. Irudia).

4. irudian, fluoreszentzia-metodo kuantitatiboak detektaturiko FRQ balioak oso korrelazio handia du (R2>0,9) NGS esperimentuan lortutako datu eraginkorrekin.Marra gorria 0,2 ng/uL-ren (log10 = -0,7) berdina den FRQ balioa da.【4】

FFPE laginetarako aplikagarria izateaz gain, denbora errealeko PCR metodo kuantitatiboak laginetako inhibitzaileak modu eraginkorrean kontrola ditzake.Detektatu beharreko lagina Barne Kontrol Positiboarekin (IPC) eta haren Saiakuntzarekin gehitu dezakegu erreakzio-sisteman, eta ondoren fluoreszentzia-kuantifikazioa egin Ct balioa lortzeko.Laginrik gabeko erreakzioan Ct balioa Ct balioaren atzetik geratzen bada, inhibitzailea laginean dagoela adierazten du eta erreakzioaren anplifikazio-eraginkortasuna galarazten du.

05 Qubit koloratzaile fluoreszenteen metodoa

Qubit Fluorometroa azido nukleikoen kontzentrazioa eta purutasuna detektatzeko gehien erabiltzen den gailu txikia da, funtzionatzeko erraza dena eta ia biologia molekularreko laborategi guztietan dagoena.Azido nukleikoaren kontzentrazioa zehaztasunez kalkulatzen du koloratzaile fluoreszentea detektatuz eta azido nukleikoarekin lotzen duen (Qubit detektatzeko erreaktiboa).Qubit-ek sentikortasun eta espezifikotasun handiak ditu, eta RNA zehaztasunez kuantifikatu dezake pg/µL kontzentrazioraino.Azido nukleikoen kontzentrazioa zehaztasunez kuantifikatzeko gaitasun ezagunaz gain, Thermo Fisher-en azken modelo berriak, Qubit 4.0, RNAren osotasuna ere detektatu dezake.Qubit 4.0-ren RNA detektatzeko sistemak (RNA IQ Assay) RNAren osotasuna detektatzen du bi koloratzaile fluoreszente zehatz detektatuz aldi berean.Bi koloratzaile fluoreszente hauek RNA zati handiekin eta zati txikiekin lotu daitezke, hurrenez hurren.Bi koloratzaile fluoreszente hauek laginaren RNA zati handien proportzioa adierazten dute, eta hortik ARNaren kalitatea adierazten duen IQ (Integrity and Quality) balioa kalkula daiteke.IQ balioa FFPE zein FFPE ez diren laginei aplikatzen zaie, eta eragin handia du ondorengo sekuentziazio-kalitatean.NGS esperimentuak adibide gisa hartuta, Ion torrent™ plataforman egindako RNA-Seq test esperimentuetan, 4 baino gehiagoko IQ balioak dituzten lagin gehienek gutxienez % 50eko irakurketa eraginkorra izan zuten (5. irudia).Aipatutako detekzio-metodoekin alderatuta, Qubit IQ Saiakera funtzionatzeko erosoagoa izateaz gain denbora gutxiago behar du (bost minutuko epean), neurtutako IQ balioaren eta beheranzko esperimentuen datuen kalitatearen arteko korrelazio handia ere badu.

5. Irudian, Qubit RNA IQ balioaren eta RNA-Seq-en mapatutako irakurketen artean korrelazio handia dago.【5】

Goiko sarreraren bidez, uste dut denek nahikoa ulertzen dutela RNAren kalitatea kontrolatzeko metodo desberdinak.Praktikan, aukera dezakezudagokion metodoa lagin motaren eta dauden tresnen arabera.RNAren kalitatea ondo kontrolatuz bakarrik saihestu dezakegu laginaren kalitate txarrak eragindako ondorengo esperimentuen porrota, eta horrela denbora, energia eta kostu preziatua aurreztuko dugu.

Erreferentziako produktuak:

Animalien RNA osoa isolatzeko kit

Zelula Guztira RNA isolatzeko kit

erreferentziak

【1】Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.RIN: RNAren osotasun-zenbakia RNA-ren neurketei osotasun-balioak esleitzeko.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Oncomine Human Immun Repertoire User Guide (Pub. No. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Enhanced Quality Metrics for Assessing RNA Derived From Archival Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue Samples, Toxicological Sciences, 170. liburukia, abuztua 23. 19.https://doi.org/10.1093/toxsci/