1. Hasierako ulermena

Etapa honetan, zenbait kontzeptu eta terminologia ulertu behar ditugu, gure adinekoen aurrean akatsak ez egiteko, hala nola:

G: Zein da RT-PCR, qPCR, denbora errealeko PCR eta denbora errealeko RT-PCRren artean?

Erantzuna: RT-PCR alderantzizko transkripzioaren PCR da(alderantzizko transkripzioa PCR, RT-PCR), polimerasaren kate erreakzioaren (PCR) aldaera oso erabilia dena.RT-PCR-n, RNA kate bat DNA osagarrian alderantziz transkribatzen da, eta ondoren PCR bidez DNA anplifikatzeko txantiloi gisa erabiltzen da.
Denbora errealeko PCR eta qPCR(Rea-ltime-PCR kuantitatiboa) gauza bera dira, biak denbora errealeko PCR kuantitatiboa dira, hau da, PCR ziklo bakoitzak denbora errealeko datu-erregistroak ditu, beraz, hasierako txantiloien kopurua analisi zehatza doi daiteke.

Denbora errealeko PCR (denbora errealeko PCR kuantitatiboa fluoreszentea) eta alderantzizko transkripzioko PCR (alderantzizko transkripzioko PCR) RT-PCR gisa laburtua dirudien arren, nazioarteko konbentzioa hauxe da: RT-PCR berariaz alderantzizko transkripzioari egiten dio erreferentzia.PCR, denbora errealeko PCR orokorrean qPCR gisa laburtzen da (quantitative real-time PCR).

Eta denbora errealeko RT-PCR (RT-qPCR), alderantzizko transkripzioaren PCR da teknologia kuantitatibo fluoreszentearekin konbinatuta.: lehenik cDNA (RT) lortu RNA alderantzizko transkripziotik, eta, ondoren, erabili denbora errealeko PCR analisi kuantitatiborako (qPCR).Laborategi gehienek RT-qPCR egiten dute, hau da, RNA adierazpenaren beheranzko erregulazioari buruzko ikerketak, beraz, laborategian denek hitz egiten duten qPCR-ak benetan RT-qPCRri egiten dio erreferentzia, baina ez ahaztu aplikazio klinikoetan oraindik DNA proba asko daudela.Azterketa kuantitatiboa, esaterako, B hepatitisaren birusa HBV detektatzea.

Galdera: PCR kuantitatibo fluoreszente asko irakurri ondoren, zergatik kontrolatu behar da zati anplifikatua 80-300bp-ren artean?

Erantzun: Gene-sekuentzia bakoitzaren luzera desberdina da, batzuk hainbat kb dira, beste batzuk ehunka bp, baina produktuaren luzera 80-300bp izan dadila behar dugu abiarazleak diseinatzerakoan, laburregiak edo luzeegiak ez dira egokiak PCR kuantitatibo fluoreszenteak detektatzeko.Produktu zatia laburregia da primer-dimerotik bereizteko.Primer-dimeroaren luzera 30-40bp ingurukoa da, eta zaila da bereiztea primer-dimero bat den ala produktu bat 80bp baino txikiagoa bada.Produktu zatia luzeegia bada, 300bp gainditzen badu, erraz anplifikazio-eraginkortasun baxua ekarriko du eta ezin izango du genearen zenbatekoa modu eraginkorrean detektatu.

Adibidez, ikasgela batean zenbat pertsona dauden zenbatzen duzunean, zenbat aho dauden bakarrik zenbatu behar duzu.Gauza bera gertatzen da geneak detektatzen dituzunean, gene baten sekuentzia jakin bat bakarrik detektatu behar duzu sekuentzia osoa irudikatzeko.Pertsonak zenbatu nahi badituzu, ahoa zein sudurra, belarriak eta betaurrekoak zenbatu behar dira, eta erraza da akatsak egitea.

Zabaltzeko, ikerketa biologikoan, ikerketa kasu asko daude puntuz eremu, edozein espezieren gene-sekuentzia oso luzea delako, alferrikako eta ezinezkoa da zati guztiak neurtzea, hala nola bakterioen 16S sekuentziazioa, hau da, bakterioen sekuentzia kontserbadorea Entseguak bakterioen populazio jakin baten kopurua ondorioztatzeko.

G: Zein da qPCR lehen diseinurako luzera optimoa?

Erantzun: Oro har, lehen luzera 20-24bp ingurukoa da, hau da, hobea.Noski, lehengaiaren TM balioari erreparatu behar diogu inprimaketa diseinatzerakoan, hori errekostatzeko tenperatura optimoarekin lotuta dagoelako.Esperimentu askoren ondoren, 60 °C TM balio hobea dela frogatu da.Erretiro-tenperatura baxuegia bada, erraz anplifikazio ez-espezifikoa ekarriko du.Anplifikazio-tenperatura altuegia bada, anplifikazio-eraginkortasuna nahiko baxua izango da, anplifikazio-kurbaren gailurra geroago hasiko da eta CT balioa atzeratuko da.

G: Nola desberdina da koloratzaileen metodoa zunda metodotik?

Erantzuna: Dye metodoaTindagai fluoreszente batzuek, hala nola SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, etab., ez dute argirik igortzen berez, baina fluoreszentzia igortzen dute hari bikoitzeko DNAren zirrikitu txikiari lotu ondoren.Horregatik, PCR erreakzioaren hasieran, makinak ezin du seinale fluoreszentea hauteman.Erreakzioa annealing-hedatze fasera iristen denean, kate bikoitza irekitzen da, eta kate berri bat sintetizatzen da DNA polimerasaren eraginez, eta molekula fluoreszentea dsDNA zirrikitu txikira lotzen da.PCR zikloen kopurua handitu ahala, gero eta koloratzaile gehiago konbinatzen dira kate bikoitzeko DNArekin, eta seinale fluoreszentea ere etengabe hobetzen da.Tindaketa metodoa ikerketa zientifikoan erabiltzen da batez ere.
PS: Kontuz ibili esperimentua egiterakoan, koloratzailea giza DNArekin konbinatu behar da, kontuz pertsona fluoreszente bihurtzeko.

Dye metodoa (ezkerrean) Zunda metodoa (eskuinean)
PS: Kontuz ibili esperimentua egiterakoan, koloratzailea giza DNArekin konbinatu behar da, kontuz pertsona fluoreszente bihurtzeko.

SYBR Green Ⅰ DNAren zirrikitu txikiarekin lotzen da

Zundaketa metodoaTaqman zunda hidrolisi-zunda erabiliena da.Zundaren 5′ amaieran talde fluoreszente bat dago, normalean FAM, eta zunda bera xede genearen osagarri den sekuentzia bat da.3′ amaieran itzaltze-talde fluoreszente bat dago.Fluoreszentzia-erresonantzia-energia-transferentziaren printzipioaren arabera (Förster erresonantzia-energia transferentzia, FRET), talde fluoreszente erreportaria (molekula fluoreszente emailea) eta fluoreszentzia-talde fluoreszentea (molekula fluoreszente onartzailea) kitzikatzen direnean Espektroak gainjartzen direnean eta distantzia oso hurbil dagoenean (7-10 nm), molekularen kitzikapenak autofluoreszentzia onartzen duen bitartean nce ahuldu da.Beraz, PCR erreakzioaren hasieran, zunda sisteman libre eta osorik dagoenean, talde fluoreszente berriemaileak ez du fluoreszentziarik igorriko.Errekuzitzean, abiarazlea eta zunda txantiloiarekin lotzen dira.Luzapen-etapan, polimerasak etengabe sintetizatzen ditu kate berriak.DNA polimerasak 5′-3′ exonukleasa jarduera du.Zundara iristean, DNA polimerasak zunda hidrolizatuko du txantiloitik, talde fluoreszente berriemailea kencher fluoreszente taldetik bereizi eta seinale fluoreszentea askatuko du.Zundaren eta txantiloiaren artean bat-bateko erlazioa dagoenez, zunda metodoa koloratzaileen metodoa baino handiagoa da probaren zehaztasun eta sentikortasunari dagokionez.Zunda metodoa diagnostikoan erabiltzen da batez ere.

G: Zer da kuantifikazio absolutua?Zer da kuantifikazio erlatiboa?

Erantzun: Kuantifikazio absolutua qPCR bidez probatu beharreko laginaren hasierako kopia-zenbakiaren kalkuluari egiten zaio erreferentzia, esate baterako, zenbat HBV birus dauden 1 ml odolean.Kuantifikazio erlatiboaren bidez lortzen den emaitza lagin zehatz batean xede-genearen kantitatearen aldaketa da, beste erreferentzia-lagin baten aldean, eta gene-adierazpena gora edo behera erregulatuta dago.

G: RNA erauzketa-kopuruak, alderantzizko transkripzioaren eraginkortasunak eta anplifikazio-eraginkortasunak eragingo al du emaitza esperimentaletan?
G: Laginak biltegiratzeak, erauzketa-erreaktiboak, alderantzizko transkripzio-erreaktiboak eta argia transmititzen duten kontsumigarriek emaitza esperimentaletan eragingo al dute?
G: Zein metodo zuzen ditzake datu esperimentalak?

Gai hauei dagokienez, zehatz-mehatz deskribatuko ditugu beheko atal aurreratuetan eta aurreratuetan.
2. Ezagutza aurreratuak

Denbora errealeko PCR kuantitatibo fluoreszenteari dagokionez, aitortu behar dugu urtero milaka ikerketa zientifiko lan argitaratzen diren errealitatea, eta horien artean PCR kuantitatibo fluoreszentearen teknologia ez da gutxi.

PCR kuantitatibo fluoreszentearen esperimentua neurtzeko estandar komunik ez badago, emaitzak asko alda daitezke.Espezie bereko gene berarentzat, prozesatzeko metodo berdinarekin, detekzio-emaitzak ere asko aldatuko dira, eta zaila izango da berandu etorriko direnentzat emaitza berdinak errepikatzea.Zu Inork ez daki zein den zuzena eta zein okerra.

Horrek esan nahi al du PCR kuantitatibo fluoreszentea iruzur-teknologia edo teknologia fidagarria dela?Ez, PCR kuantitatibo fluoreszentea sentikorragoa eta zehatzagoa delako da, eta eragiketa oker txiki batek guztiz kontrako emaitzak emango ditu.Galera txiki bat mila kilometrora dago.Artikuluaren egilea behin eta berriz torturatu dezakete ebaluatzaileek.Aldi berean, aldizkariaren berrikusleak ere zailak dira emaitza esperimental desberdinetatik aukeratzea.

Oro har, denbora errealeko PCR esperimentuetan adostasun falta adieraziz.Horretarako, industriako goi mailako zientzialariak estandarrak formulatzen hasi ziren,kolaboratzaileek arau hauek betetzeko beharrezkoak diren esperimentu eta datuak prozesatzeko xehetasun batzuk (beharrezko datuak barne) eman behar dituzte artikuluan.

Berrikusleek esperimentuaren kalitatea epai dezakete xehetasun hauek irakurrita;etorkizuneko irakurleek hau ere erabil dezakete esperimentua errepikatzeko edo esperimentua hobetzeko.Orduan, horrela lortutako emaitza esperimentalak informazioz beteta daude, kalitate handikoak eta erabilgarriak.

MIBBI (Ikerketa Biologiko eta Biomedikoetarako Gutxieneko Informazioa -http://www.mibbi.org) sortu zen.MIBBI esperimentuetarako estandarrak ematen dituen proiektua da.Naturan argitaratzen da.Proiektu hau hainbat esperimentu biologikotara zuzenduta dago, besteak beste, orain eztabaidatuko dugun biologia zelularra, Mikroarray, qPCR, etab., eta eskuizkribuak bidaltzerakoan esperimentu mota bakoitzari dagokio.Informazio hori uneoro eman behar da.

MIBBI proiektuan, PCR kuantitatibo fluoreszentearekin lotutako bi artikulu daude, alegia:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) – denbora errealeko PCR datu kuantitatiboetarako lengoaia egituratua eta txostenak egiteko gida;
·MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) – denbora errealeko PCR esperimentu kuantitatiboei buruzko artikuluak argitaratzeko gutxieneko informazioa.
Lehenik eta behin, hitz egin dezagun RDMLri buruz, terminologia-zehaztapenari buruz.

Guztiaren definizio estandarrik ez badago, ezinezkoa da eztabaidan jarraitzea, horregatik terminoen azalpena oso garrantzitsua da azterketan.
PCR kuantitatibo fluoreszentearen esperimentuan erabilitako terminologiak honako edukia du.QIAGENek laburpenik onena egin digu.Honako hauek guztiak lehorrak diraondasunak .

Anplifikazio-kurba
Anplifikazio-kurbak PCR prozesuan egindako kurbari egiten dio erreferentzia, ziklo-zenbakia abszisa gisa eta erreakzioaren denbora errealeko fluoreszentzia-intentsitatea ordenatua izanik.

Anplifikazio-kurba bikain batek ezaugarri hauek izan behar ditu: oinarri-lerroa laua edo apur bat jaitsi da, eta ez dago goranzko joera nabaririk;kurbaren inflexio-puntua argia da, eta fase esponentzialaren malda anplifikazio-eraginkortasunarekiko proportzionala da.Zenbat eta malda handiagoa izan, orduan eta handiagoa izango da anplifikazio-eraginkortasuna;anplifikazio-kurba orokorra Paralelismoa ona da, hodi bakoitzaren anplifikazio-eraginkortasuna antzekoa dela adierazten du;nabaria da kontzentrazio baxuko laginen anplifikazio-kurbaren fase esponentziala.

Oinarrizko lerroa (oinarrizko lerroa)
Oinarrizko lerroa hasierako zikloaren zarata-maila da, normalean 3. eta 15. zikloaren artean neurtuta, anplifikazio-produktuak eragindako fluoreszentzia-balioaren igoera ezin delako detektatu aldi horretan.Oinarrizko lerroa kalkulatzeko erabiltzen den ziklo-kopurua askotarikoa izan daiteke eta baliteke murriztu behar izatea txantiloi kopuru handiak erabiltzen badira edo xede-genearen adierazpen-maila handia bada.

Oinarrizko lerroa ezartzeak linealtasun-anplifikazio-kurbako fluoreszentzia-datuak ikustea eskatzen du.Oinarrizko lerroa ezartzen da anplifikazio-kurbaren hazkundea oinarrizko zikloaren goiko zenbakia baino ziklo-zenbaki batekin hasten da.Helburu-sekuentzia bakoitzerako oinarri-lerroak banaka ezarri behar dira.Hasierako zikloetan hautemandako batez besteko fluoreszentzia-balioak anplifikatutako produktuetan lortutako fluoreszentzia-balioei kendu behar zaizkie.Denbora errealeko PCR software ezberdinen azken bertsioek lagin indibidualentzako oinarrizko ezarpenen optimizazio automatikoa ahalbidetzen dute.

PCR anplifikazio erreakzioaren lehen zikloetan, fluoreszentzia seinalea ez da asko aldatzen.Lerro zuzen batera hurbiltzeari oinarri-lerroa deitzen zaio, baina lehenengo zikloei arretaz begiratzen badiegu, ikusiko dugu oinarri-lerroaren barruan beheko irudian gertatzen ari dena.

Atzeko planoa aipatzen du
erreakzioko fluoreszentzia-balio ez-espezifikoa.Adibidez: fluoreszentzia itzaltze eraginkorra;edo kate bikoitzeko DNA txantiloi ugari SYBR Green erabiltzeagatik.Seinalearen hondoko osagaiak denbora errealeko PCR software algoritmoak matematikoki kentzen ditu.

Erreportariaren seinalea
Reporter-seinalea SYBR Green edo fluoreszenteki etiketatutako sekuentzia espezifikoen zundek sortutako seinale fluoreszenteari dagokio, denbora errealeko PCRn zehar.

Txostenaren seinale normalizatua (RN)
RN koloratzaile berritzailearen fluoreszentzia-intentsitateari egiten dio erreferentzia ziklo bakoitzean neurtutako erreferentzia pasiboaren fluoreszentzia-intentsitatearekin zatituta.

Erreferentziazko tindagai pasiboa
Denbora errealeko PCR batzuetan,ROX koloratzaile fluoreszentea barneko erreferentzia gisa erabiltzen da seinale fluoreszentea normalizatzeko.Pipetea, putzuaren posizioa eta fluoreszentzia-gorabeheren ondoriozko aldaerak zuzentzen ditu ondoz putzu.

Fluoreszentzia atalasea (atalasea)
atzeko planoaren balioaren gainetik eta anplifikazio-kurbaren meseta-balioaren azpitik nabarmen egokitu zen.Anplifikazio-kurbaren eskualde linealean egon behar du, PCR detektatzeko tarte log-lineala irudikatuz.Atalaseak log-anplifikazio kurbaren ikuspegian ezarri behar dira, PCRren fase log-lineala erraz identifika dadin.Denbora errealeko PCRan helburu-gene bat baino gehiago badaude, helburu bakoitzerako atalasea ezarri behar da.Orokorrean, PCR erreakzioaren lehen 15 zikloetako fluoreszentzia-seinalea fluoreszentzia-atzealdeko seinale gisa erabiltzen da, eta fluoreszentzia-atalasea PCR-ren lehen 3 eta 15 zikloetako fluoreszentzia-seinalearen desbideratze estandarra 10 aldiz da, eta fluoreszentzia-atalasea PCRren anplifikazio esponentzialean ezartzen da.Oro har, tresna bakoitzak bere fluoreszentzia atalasea ezarrita dauka erabili aurretik.

Zikloaren Atalasea (CT) edo Zeharkaldi Puntua (CP)
Anplifikazio-kurbak atalasea gainditzen duen zikloa (hau da, fluoreszentzia detekzioa nabarmen handitzen den puntua).CT frakzio bat izan daiteke eta hasierako txantiloiaren zenbatekoa kalkula daiteke.CT balioak PCR erreakzio-hodi bakoitzeko seinale fluoreszentea ezarritako atalasea iristen denean bizitako ziklo kopurua adierazten du.Erlazio lineala dago txantiloi bakoitzaren CT balioaren eta txantiloiaren hasierako kopiaren zenbakiaren logaritmoaren artean,hasierako kopia-zenbakia handiagoa, CT balioa txikiagoa izango da, eta alderantziz.Kurba estandar bat egin daiteke hasierako kopia-zenbaki ezaguna duen estandarra erabiliz, non abzisak CT balioa adierazten duen eta ordenatuak hasierako kopia-zenbakiaren logaritmoa adierazten duen.Beraz, lagin ezezagunaren CT balioa lortzen den bitartean, laginaren hasierako kopia-zenbakia kurba estandartik kalkula daiteke.

ΔCT balioa
ΔCT balioa deskribatzen duxede-genearen eta dagokion erreferentzia-gene endogenoaren CT balioaren arteko aldea, hala nola etxeko gene bat, eta erabilitako txantiloi kopurua normalizatzeko erabiltzen da:
⇒ΔCT = CT (helburuko genea) – CT (erreferentziako gene endogenoa)

ΔΔCT Balioa
ΔΔCT balioak intereseko lagin baten batez besteko ΔΔCT balioaren (adibidez, estimulatutako zelulak) eta erreferentziako lagin baten batez besteko ΔΔCT balioaren (adibidez, estimulatu gabeko zelulak) arteko aldea deskribatzen du.Erreferentzia-lagina kalibrazio-lagina ere deitzen da eta gainerako lagin guztiak honetara normaltzen dira kuantifikazio erlatiborako:
⇒ΔΔCT = batez besteko ΔCT (intereseko lagina) – batez besteko ΔCT (erreferentziako lagina)

Erreferentzia-gene endogenoak (erreferentzia-gene endogenoak)
Erreferentzia-gene endogenoen adierazpen-mailak, hala nola etxeko geneak (etxeko geneak), ez dira laginen artean desberdinak.Erreferentzia-genearen CT balioak xede-genearekin alderatuz, xede-genearen adierazpen-maila sarrerako RNA edo cDNA-ren kantitatera normalizatzea ahalbidetzen du (ikus goiko ΔCT balioei buruzko atala).

Barne erreferentziako geneak zuzenak diraRNAren degradazio posiblea edo RNA laginetan entzimaren inhibitzaileen presentzia, baita RNA edukiaren aldaerak, alderantzizko transkripzioaren eraginkortasuna, azido nukleikoen berreskurapena eta laginak maneiatzea.Erreferentzia-gene optimoa(k) hautatzeko, algoritmoa aldatu dugu erreferentzia optimoa aukeratzeko ezarpen esperimentalaren arabera.

Barne kontrola
Helburu-sekuentziaren erreakzio berean anplifikatzen den kontrol-sekuentzia eta zunda ezberdin batekin zundatzen dena (hau da, PCR duplexa eginez).Barne-kontrolak askotan huts egindako anplifikazioak baztertzeko erabiltzen dira, adibidez, xede-sekuentzia detektatzen ez denean.
Kalibrazio Lagina
Erreferentzia-lagina (adibidez, zelula-lerro edo ehun bateko RNA araztua) kuantifikazio erlatiboan erabilitako beste lagin guztiak alderatzeko gene baten adierazpen-maila erlatiboa zehazteko.Kalibrazio-lagina edozein lagin izan daiteke, baina normalean kontrol bat da (adibidez, tratatu gabeko lagina edo esperimentuaren zero denboratik datorren lagina).

Kontrol positiboak
kontrol-erreakzioekin erabilitxantiloi kopuru ezagunak.Kontrol positiboak sarritan erabiltzen dira abiarazle-multzoa edo abiarazte-zunda-multzo batek behar bezala funtzionatzen duela eta erreakzioa behar bezala konfiguratuta dagoela egiaztatzeko.

Txantiloi-kontrolik (NTC)
Anplifikazio-erreakzioaren beharrezko osagai guztiak dituen kontrol-erreakzioa txantiloia izan ezik, normalean urarekin ordezkatzen dena.NTC erabiltzeak erreaktiboen kutsadurak edo atzerriko DNAk eragindako kutsadura aurki dezake, horrela detektatzeko datuen benetakotasuna eta fidagarritasuna bermatuz.NTC kontrola handitzeak kutsadura adierazten du.

RT kontrolarik ez (NRT)
RNA erauzteko prozesuak DNA genomiko hondar eduki dezake, oso kaltegarria dena eta datuen kalitateari eragiten dion erruduna eta qPCRren etsai naturala da, beraz, esperimentuak diseinatzerakoan, RNA detekzioa areagotzeko soilik diseinatu behar da.Bi modu daude, bata introietan zehar abiarazleak diseinatzea da, bestea DNA erabat kentzea, zein den hobea, geroago aztertuko dena.NTR kontrola DNAren kutsadura detektatzeko ispilu magiko bat da.Anplifikazioa badago, kutsadura dagoela esan nahi du.

Arauak
Estandarrak kontzentrazio edo kopia-zenbaki ezaguneko laginak dira, kurba estandar bat eraikitzeko erabiltzen direnak.Estandarraren egonkortasuna bermatzeko, gene-zatiak plasmidoan klonatu ohi dira eta estandar gisa erabiltzen dira.

Kurba estandarra
normalean produktu estandarrarekin gutxienez 5 kontzentrazio-gradientetan diluitzen da bikoizketa-erlazioaren arabera, eta 5 puntu marrazten dira CT balioaren eta kopia-zenbakiaren koordenatuetan, eta puntuak lerro bat osatzen dute kurba estandar bat sortzeko.Kurba estandar bakoitzeko, bere baliozkotasuna egiaztatu behar da.Malda-balioa –3,3 eta –3,8 artean kokatzen da, eta kontzentrazio bakoitza hiru aldiz egiten da.Beste puntuekiko nabarmen desberdinak diren puntuak baztertu behar dira.Probatu beharreko laginaren CT balioa kurba estandarrera eramaten da, eta probatu beharreko laginaren adierazpen maila kalkula daiteke.

Probatu beharreko laginaren CT balioa kurba estandarrera eramaten da, eta probatu beharreko laginaren hasierako kopia-zenbakia kalkula daiteke.

Eraginkortasuna eta Malda
Kurba estandarraren maldak denbora errealeko PCRren eraginkortasuna adierazten du.
·-3,322ko malda batek PCR anplifikazioaren eraginkortasuna 1ekoa dela, edo % 100eko eraginkortasuna, eta PCR produktuaren kopurua bikoiztu egiten da ziklo bakoitzean.
·-3,322 baino gutxiagoko malda batek (adibidez, -3,8) PCR eraginkortasuna adierazten du
·-3,322 baino malda handiagoak (adibidez, -3,0) adierazten du PCRren eraginkortasuna % 100 baino handiagoa dela, eta bitxia da, nola sor lezake PCRren ziklo batek produktu anplifikatuaren bikoitza baino gehiago?Egoera hau PCR erreakzioaren fase ez-linealean gertatzen da, hau da, anplifikazio ez-espezifiko handia dago.

urtze-kurba
qPCR anplifikazioa amaitu ondoren, PCR produktua berotzen da.Tenperatura igotzen den heinean, kate bikoitzeko anplifikazio-produktua pixkanaka urtzen da, eta ondorioz, fluoreszentzia-intentsitatea gutxitzen da.Tenperatura jakin batera (Tm) iristen denean, produktu kopuru handia urtuko da.Fluoreszentzia nabarmen jaisten da.PCR produktu ezberdinek Tm balio desberdinak eta urtze-tenperatura desberdinak dituzte, PCRren espezifikotasuna identifikatu ahal izateko.

Urtze-kurba (kurba deribatua)
Urtze-kurba gailur-mapa bat eratzen da, eta PCR produktuen zatien egoera modu intuitiboagoan bistaratu dezake.Urtze-tenperatura DNA zatiaren Tm balioa denez, DNA zatiaren Tm balioa eragiten duten parametro batzuk epai daitezke, hala nola zatiaren tamaina, GC edukia, etab. Orokorrean, gure primer diseinuaren printzipioen arabera,anplifikatutako produktuaren luzera 80-300bp bitartekoa da, beraz, urtze-tenperatura 80°C eta 90°C artekoa izan behar da.

Urtze-kurbaren interpretazioa: gailur nagusi bakarra 80°C-90°C artean agertzen bada, PCR kuantitatibo fluoreszentea perfektua dela esan nahi du;gailur nagusia 80°C-90°C artean agertzen bada eta askotariko gailurrak 80°C-tik behera agertzen badira, oinarrizko dimeroa hartzen da kontuan.Errekuzitzeko tenperatura handitzen saia zaitezke hura konpontzeko;gailur nagusia 80°C-90°C artean agertzen bada, eta askotariko gailurra berriro agertzen bada tenperatura igotzean, funtsean, DNA kutsadura dagoela kontsideratzen da, eta DNA kendu behar da esperimentuaren hasierako fasean.

Jakina, badaude oraindik egoera anormal batzuk, behean banan-banan banatuko direnak.
3. Ezagutza aurreratuak

qPCR egiteko, MIQE esan behar dut,Gutxieneko informazioaren ArgitalpenerakoKuantitatiboaDenbora errealeko PCREsperimentuak — denbora errealeko PCR kuantitatiboari buruzko artikuluak argitaratzeko gutxieneko informazioaesperimentuak .Guztion ulermena errazteko, funtsezko edukia sinplifikatuko dugu.

MIQE-ren jatorrizko testua Interneten bilatu dezakezu, eta garrantzitsuena zehazten duela daartikulu bat argitaratzean eman beharreko datuen zerrenda .

Berrikusleek esperimentuaren kalitatea epai dezakete xehetasun hauek irakurrita;etorkizuneko irakurleek hau ere erabil dezakete esperimentua errepikatzeko edo hobetzeko.
Azpimarratzekoa da zerrenda honetan zerrenda bakoitzaren garrantzia E edo D-rekin markatzen dela hurrenez hurren.Zer esan nahi du?E: funtsezko informazioa (aurkeztu behar da);D: desiragarria den informazioa (ahal den neurrian eman).

MIQE (1)—Diseinu Esperimentala
Graduondoko ikasketak amaitu ondoren defentsa amaitu duten zital askok ez dute jakingo esperimentu bat modu independentean diseinatzen, koadernoak ireki eta irakasleak agintzen diona egiten.Ondorioz, diseinu esperimentala ez zen zorrotza izan, eta aldizkariko erredakzio sailak esan zuen argazki hau eta argazki hura osatu nahi zutela, beraz, txundituta egin zuten.Honela egiten dira zakarrak!

Etxetik gertuago, esperimentuaren lehen printzipioa zehaztea dalogika esperimentalaren zorroztasuna.Oinarrizkoena diseinu esperimentala da, eta diseinu esperimentalaren gauzarik garrantzitsuena xede-lagina, erreferentzia-lagina (kontrola) eta errepikapen-kopurua nola ezartzea da, datu esperimentalak erreferentzia, konparagarriak eta konbentzigarriak izan daitezen.

Xede-laginatratamendu jakin baten ondoren xede-genea detektatzeko eskatzen duen laginari egiten dio erreferentzia.Erreferentzia laginainongo tratamendurik gabeko lagina da, biologian sarritan basatia esaten zaiona.

Erreplika esperimentalakoso garrantzitsuak dira.Orokorrean, errepikapen limurtzaileen kopurua hiru baino gehiago izan behar da.Erreplikazio biologikoa eta erreplikazio teknikoa zer den bereizi behar da.

Erreplika Biologikoak: Material ezberdinekin (denbora, landareak, loteak, erreakzio-plakak) egindako egiaztapen-esperimentu bera.

Bikoizketa biologikoa
Har dezagun adibide gisa piperraren pestizida tratamendua.ABCko hiru landareetan pestizidak ihinztatu nahi ditugu, orduan ABCko hiru landareak hiru erreplika biologiko dira, eta material ezberdinekin egindako egiaztapen-esperimentu bera dira.Baina esperimentu gisa, kontrol bat behar da behin betiko, beraz, A landarearen adarretako bat A landarearen talde esperimental bat osatzeko ihinzta dezakegu, eta ez A landarearen beste adarrak kontrol talde bat osatzeko.Egin gauza bera B eta C-rekin.

Erreplika teknikoak (erreplika teknikoak): Funtzionamenduak eragindako akatsak saihesteko diseinatutako esperimentu errepikatua da, material berean sartutako zulo bikoiztua dena.Tratamenduek zein kontrolek helburu-genearen eta barne erreferentziako genearen ezarpen erreplikatuak izan behar dituzte (gutxienez hiru).

Errepikapen teknikoa
Hartu berriro adibide gisa pestizidekin tratatutako piperra.A landarearen talde esperimentalerako, 1, 2 eta 3ko hiru PCR zulo egin genituen bere xede-generako eta barneko erreferentzia-generako hurrenez hurren, detektatu ondoren batez bestekoa hartzeko.Landarea kontrolatzeko A Taldeak ere modu berean tratatzen dira.Era berean, egin tratamendu bera B eta C landareei.Hau errepikapen teknikoa da.

Aipatzekoa da horiEstatistikan sartzen dena errepikapen biologikoa da, eta errepikapen teknikoa prozesu esperimentalean ausazko fenomenorik dagoen ala ez egiaztatzea, emaitza esperimentalak sinesgarri izateko, hau da, akatsak saihesteko haien batez bestekoa hartuz maiz esaten dugun moduan.

Kontrol negatiboak: NTC eta NRT
NTC (txantiloirik gabeko kontrola), txantiloirik gabeko kontrol bat, material esperimentala kutsatuta dagoen egiaztatzeko erabiltzen da.Orokorrean, ura txantiloi gisa erabiltzen da.Erreakzio fluoreszente bat badago, laborategian azido nukleikoen kutsadura gertatu dela adierazten du.

Kutsadura hauek datoz: ur ezpurua, DNA endogenoa duten erreaktibo kalifikatuak, primer kutsadura, laborategiko ekipoen kutsadura, aerosol kutsadura, etab., RNasen garbitzaileak eta RNasaren inhibitzaileak erabili beharra.Aerosolen kutsadura da aurkitzen zailena.Imajinatu zure laborategia smog bezalakoa dela, hainbat azido nukleiko airean esekita daudela.

NRT (alderantzizko transkriptasarik gabe), alderantzizko transkripziorik gabeko kontrola, alderantzizko transkribatutako RNA da kontrol negatibo gisa, hau da, gDNA hondakinaren kontrola.

Geneen adierazpena egiterakoan, alderantzizko transkripzioaren ondoren cDNA kopurua detektatuz detektatzen da ARN-kopurua.RNA purifikatzean gDNA hondakina badago, emaitza esperimentaletan akatsak eragingo ditu, lortutako benetako emaitzak gDNA eta cDNA direlako.Maila agregatuan, ez cDNA bakarrik, gDNA erabat kendu behar da RNA erauzketan.

MIQE (2)—lagin-informazioa
Laginaren informazioa deiturikoak esan nahi du qPCRri buruzko artikulu bat argitaratzen dugunean, laginaren informazioa argi azaldu behar dugula, hau da, artikuluaren ezinbesteko zati bat.Era berean, laginak prozesatzen ditugunean, gure eragiketak ere arautu behar ditugu laginen baliozkotasuna bermatzeko.

Laginaren deskribapena emaitza bat baino ez da, eta esperimentu osoan zehar hartutako materialei arreta gehiago jarri beharko genieke.

Material esperimentalen hautaketa
Odol laginak - aukeratu odol freskoa, gehienez 4 ordu.Zelulen laginak: aukeratu zelula freskoak biltzea hazkuntza biziko aldi batean.Animalien ehuna - Aukeratu ehun freskoa eta indartsu hazten ari dena.Landare-ehuna - Aukeratu ehun freskoa eta gaztea.

Konturatu behar zara esaldi gutxi hauetan gako-hitz bat dagoela: freskoa .
Goiko laginetarako, merkatuan dagoen kit onena, errentagarria eta egonkorra Foregene-ren kit-a da, zeinak azkar eta erraz atera ditzake bere DNA eta RNA.

Blood DNA Mini Kit

Zelula Guztira RNA isolatzeko kit

Animalien RNA osoa isolatzeko kit

Landare Guztira RNA isolatzeko kit

Landare Guztira RNA Isolation Kit Plus

Landareen DNA isolatzeko kit

Material esperimentalak biltegiratzea
Oro har, ez dugu gomendatzen laginak gordetzea, baldin eta baldintzek ahalbidetzen badute.Hala ere, lagun asko daude laginketa egin eta berehala esperimentuak egin ezin dituztenak, eta batzuek nitrogeno likidoko deposituak ere eraman behar dituzte laginak hartzera.

Mota honetako lagun langileentzat, erreaktibo kontsumigarriak ez dituzula ulertzen esan dezaket.Orain erreaktibo kontsumigarrien konpainia askok RNA laginak giro-tenperaturan gorde ditzaketen erreaktiboak ekoizten dituzte eta horiek erabiltzea aukeratu dezakezu.Biltegiratze ohiko metodoa nitrogeno likidoa biltegiratzea da, eramateko erraza den nitrogeno likido depositu txiki bat erabiliz.Lagina laborategira itzuli ondoren, gorde -80 °C hozkailuan.

RNArekin lotutako esperimentuetarako, sei hitzen printzipioa jarraitu behar da:tenperatura baxua, entzimarik gabe,etaazkar .

Tenperatura baxuaren kontzeptua erraz ulertzen da;entzimarik gabe, RNasa bizi garen munduko toki guztietan dago (bestela GIBak hilko zinateke), beraz, esperimentuak egiterakoan RNasa nola saihestu oso kontzeptu garrantzitsua da;azkar,Munduan ez dago apurtu ezin den Kung Furik, abiadura bakarrik ezin da hautsi.

Horregatik, zentzu batean, zenbat eta laburragoa izan erauzketa denbora, orduan eta hobea izango da kit.Zergatik egiten duForegene's kit-ak abiadura azpimarratzen du, ondo ezagutzen dutelako.

PS: Neska batzuek esperimentuak kontu handiz egiten dituzte, baina ez dira slam dunk bat bezain onak izaten hainbat urtetako lanaren ondoren.Jainkoa bidegabea dela sentitzen dute, besteez kexatzen eta bizitzaren bila.Izan ere, ez zuen ulertzen.Ez zuen RNA ondo babestu, eta slam dunk jokalaria arina zen.Esperimentua egiten ari zenean, slam dunk hiru aldiz, bost aldiz eta bi zatirekin amaituko zuela pentsatu zuen, baina ondo egin zuen esperimentua.

Ohar: Astiroagoa, RNasa inbaditzeko aukera gehiago.Nola entrenatu zure burua azkarra izateko?Ez dago modurik, gehiago praktikatu.

Esperimentu ezberdinetarako eta lagin ezberdinetarako, oraindik beharrezkoa da literatura gehiago irakurtzea eta prozesatzeko metodo egokia aukeratzea.Laginak biltzeko eta biltegiratzeko prozesurako, MIQE-k paperean argi eta garbi idatzi behar duela eskatzen du, ebaluatzaileek paperaren fidagarritasuna berrikusteko, eta harrituta dauden gazteek zure esperimentua errepikatzea ere komenigarria da.

Esperimentu biologikoak zailak diren arren, goi mailakoak dira.Kontuz ibili ezean, mundua irauli dezakezu.Adibidez, SARS krisi biokimiko bihurtzea, edo arroz hibridoa egitea 1.300 milioi pertsona salbatzeko.Beheko irudia esperimentu kimiko bat da, zure ikerketez zein harro zauden ulertu beharko zenuke bere zakila itxurari begiratuta.Ahaztu, ez belztu.

MIQE (3) – azido nukleikoen erauzketa.
Azido nukleikoen erauzketa gertaera handia da, eta biologia molekularreko esperimentu guztiak azido nukleikoen erauzketarekin hasten dira.Lehenik eta behin, kopia ditzagun MIQEren edukia azido nukleikoen erauzketari buruz.

Forma honi begiratuta, ezin zara azalean geratu.Forma dogma bat da.Goi mailako ikaslea izateko, zergatik galdetu behar duzu.Taula honen funtsezko edukia hau da: JarraituRNAren garbitasuna, osotasuna, koherentzia eta erauzketa kopurua .

Lehen zatiaprozesua edo tresna azido nukleikoak erauzteko urratsa da.Erauzteko azido nukleikoen erauzgailu automatikoa erabiltzen baduzu (aurreratua, jar zaitez nirekin harremanetan erosteko), tresnaren ereduaren izena adierazi behar duzu.

Kitaren izena eta

Aldaketaren xehetasunetarako zer kit erabili den, zer erreaktibo berezi gehitu diren edo zer eragiketa berezi egin diren argi eta garbi azaldu behar da, besteek zure esperimentua erraz errepika dezaten.

Batzuek erreaktibo berezi batzuk gehitzen dituzte lagin bereziak ateratzen dituztenean, haien arma sekretua dela pentsatuz eta besteei ez dietela esan.Isilpean gordeta, zure artikulua distira egiteko aukera ere galtzen dute.Ez izan argia, Zhang herrialde zaharra baino zintzoagoa izan behar duzu ikerketa zientifikoan, argia izan nahi baduzu, artikuluak ergel bihurtuko zaitu.

kitaren produktuaren zenbakia gogoratu behar dukit-a eskatu eta artikulua idaztean .Oro har, bi zenbaki daude kitan: Cat—katalogo-zenbakia (produktu-zenbakia, artikulu-zenbakia), Lotea—produktuen lote-zenbakia (produktua zein lotetakoa den adierazteko erabiltzen da).

Horrez gain, erreaktibo biokimikoak eskatzeko askotan CAS zenbakia erabiltzen da, eta elkarrekin popularizatuko dut.CAS zenbakia American Chemical Society-k botika kimiko berri bakoitzari ematen dion zenbakia da.Orokorrean, hiru zenbaki marra baten bidez lotzen dira.Rushuiren CAS zenbakia: 7732-18-5.Kimikoek askotan ezizena ugari dituzte, baina CAS zenbakia bakarra da.Medikuntza eskatzerakoan, lehenik eta behin bere CAS zenbakia egiaztatu dezakezu.

Etxetik gertuago, zergatik deskribatu behar ditugu gauza hauek argi eta garbi?Izan ere, RNA erauzketaren kalitatea egiaztatzeko ere bada.Tresna eta kitak erabiltzeak RNA erauzketa koherenteagoa izango du.Laborategi arrunten erauzketa eskala ez da handia, eta kitekin lor daiteke.

DNasa edo RNasaren tratamenduaren xehetasunak
PCR kuantitatibo fluoreszentearen arazo garrantzitsua DNAren kutsadura saihestea da, eta ez esperimentatu kutsadura badago.Hori dela eta, ezinbestekoa da DNA prozesatzeko erabili duzun prozesua adieraztea, prozesu esperimentaleko DNA guztiz eta guztiz kendu dela frogatzeko.diagrama eskematiko baten bidez irudikatuta.

RNA eta DNAren eskema eskematikoa
Oro har, DNA kentzeko metodoa RNA DNasarekin tratatzea da erauzketa ondoren.Hala ere, metodo nahiko zaharrak dira.RNA erauzteko kit komertzialak erauzketa prozesuan DNA kentzeko gai izan dira DNasa gehitu gabe.Adibidez, Foregene-ren kit sorta bat.

Ohar: RNA erauzketan DNA kentzea aho biko ezpata oso arriskutsua da, eta horrek RNA erauztearen funtzionamendu-denbora luzatuko du eta RNA degradatzeko arriskua areagotuko du.Funtsean, RNA etekinaren eta garbitasunaren arteko trukea da.

Horrez gain, silizean oinarritutako adsortzio zutabeari gehitutako DNasa kopurua oso txikia da, eta kalitate handiko DNasa erabili behar da efektua lortzeko.Optimizatu gabeko DNasa ezin da azkar eta guztiz digeritu.Hau merkatariaren maila teknikoaren proba da.Noski, badaude merkatari arraroagoak, DNA DNasarik gabe ken daitekeela harrotzen dutenak.Esan daiteke DNasarik gabe DNA guztiz ken daitekeela harrotzen duen edonor hooligan bat dela.DNA kate bikoitzeko egitura nahiko egonkorra da, eta ezin da ezabatu hitz eginez eta barrez soilik.

Kutsaduraren ebaluazioa
ebaluazio-metodoa: elektroforesiaren detekzioa, 1% agarosa, 6V/cm, 15min, karga 1-3 ul

Azido nukleikoen analisi kuantitatiboa
UV espektrofotometro baten bidez neurtzen da normalean.Utzidazu lehenik OD260, OD280 eta OD230 hiru balioen esanahia ezagutarazten.
·OD260nm: azido nukleikoaren xurgapen-gailur handienaren xurgapen-uhin-luzera da, eta neurtutako balio onena 0,1 eta 1,0 bitartekoa da.Hala ez bada, diluitu edo kontzentratu lagina barrutian sartzeko.
·OD280nm: proteina eta substantzia fenolikoen xurgapen-gailur handienaren xurgapen-uhin-luzera da.
·OD230nm: karbohidratoen xurgapen-gailur handienaren xurgapen-uhin-luzera da.

Jarraian, hitz egin dezagun adierazle bakoitzaren eginkizunari buruz.A260rako, azido nukleikoaren etekina neurtzeko erabil daiteke.OD260=1 denean, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

Garbitasuna lortzeko, normalean ikusten ditugun ratioak aztertu behar ditugu: OD260/280 eta OD260/230.
·DNA purua: OD260/280 gutxi gorabehera 1,8ren berdina da.1,9 baino handiagoa denean, RNA kutsadura dagoela adierazten du, eta 1,6 baino txikiagoa denean, proteina eta fenol kutsadura dagoela adierazten du.
·RNA hutsa: 1,7
·OD260/230: DNA edo RNA izan, erreferentzia-balioa 2,5 da.2,0 baino txikiagoa denean, azukre, gatz eta materia organikoen kutsadura dagoela adierazten du.

RNAren osotasuna

Oso garrantzitsua da RNAren osotasuna neurtzea.Orokorrean, beharrezkoa da RNA desnaturalizazio gelaren esperimentua egitea 28S eta 18S RNAren arteko distira erlazio bikoitza den egiaztatzeko.Hirugarren 5S banda agertzen denean, RNA degradatzen hasi dela esan nahi du, ornogabeak izan ezik.

RNAren kalitatearen ebaluaziorako datuak: Aurreko probez gain, RNAren osotasunari dagokionez tresna proba aurreratuago batzuk ere badaude, hala nola, Experion elektroforesi sistema automatikoaren RQI osotasunaren proba, RNA ikusezinean degradatzen den ala ez hauteman dezakeena.

Ikerketa zientifikoan, PCR kuantitatibo fluoreszentea xede-genearen eta barneko erreferentzia-genearen arteko konparazioa da.Hori dela eta, RNA laginak kontserbatzeko, RNA erauzteko, etab., helburu nagusia RNAren osotasuna bermatzea da.

RNAren osotasunak xede-genearen eta barne erreferentziako genearen arteko orekan nola eragiten duen erraz uler daiteke beheko iruditik.Degradazioak geneen osatugabetasuna ekarriko du, barne erreferentziako genearen osatugabetasuna dela edo xede genearen osatugabetasuna dela, eragin handia izango du datuetan.

Xede-genearen eta erreferentzia-genearen diagrama eskematikoak ez du egia izan behar

Inhibizio proba (CT balioa kentzen den kontzentrazio altuan edo baxuan edo beste baldintza batzuetan)

Irudi hau adibidetzat hartuta, bost kurben Ct balioak hauek dira.Kurben arteko CT balioen banaketa irregularra da, eta Ct balioak atzeratzen dira kontzentrazio altu eta baxuetan, PCR inhibizioaren kasua da.

Gakoa: RNA erauzteko prozesuan uste okerrak alde batera utzi eta zuzenak ezarri behar ditugu.

Ideia okerra zera da: RNA erauzteak etekina baino ez du bilatzen, lortutako RNA kantitatea zenbat eta handiagoa izan, orduan eta hobeto.Izan ere, kuantifikazioa egiten dugunean, gene kopurua oso handia ez bada, ez dugu ARN askorik behar.Erauzten duzun RNA kopurua nahikoa da.

Kontzeptu zuzena hau da:RNA erauzteak garbitasuna, osotasuna eta koherentzia izan behar ditu.Garbitasunak ondorengo alderantzizko transkripzioa galarazten ez duela eta datuei DNAk eraginik ez izatea berma dezake.Osotasunak xede-sekuentzien eta barne-erreferentzien oreka bermatzen du.Koherentziak laginaren karga egonkorra bermatzen du.

MIQE (4) – alderantzizko transkripzioa
Uste okerra: lagin bolumen handiagoa bilatzea.
Kontzeptu zuzena: Jarraitu koherentzia (egonkortasuna), kargatutako RNA kopurua edozein dela ere, alderantzizko transkripzioaren eraginkortasunak koherentea izaten jarraitzen du, cDNAren desberdintasunak mRNAren desberdintasunak benetan isla ditzaketela bermatuz.
Prozesu hau diagrama eskematiko batekin azaltzen dugu:

Alderantzizko transkripzioaren eraginkortasunaren diagrama eskematikoa, ez da egia
Lehenik eta behin, alderantzizko transkripzio prozesuaren eta PCR prozesuaren arteko aldea ulertu behar dugu.PCR-k berotze- eta annealing-prozesu anitz jasaten ditu, eta xede-zatiak esponentzialki hazten dira;alderantzizko transkripzioak prozesu hori ez duen bitartean, alderantzizko transkripzioa benetan bat-batekoa dela imajina dezakegu Erreplikazio-prozesuan, RNA zati asko.

cDNA Informazioaren adina zati lor daitezkeenez, honezkero ulertu behar da, zati handi eta txikiak alderantziz transkribatu direlako, eta ezinezkoa baita zati batean zentratu.Eta RNA kantitatea txiki samarra denez, lortutako cDNA ere nahiko txikia da, PCR ez bezala, anplifikazio efektua duena, beraz, funtsean ezinezkoa da detektatzea.

cDNA elektroforesiaren emaitzak
Bigarrenik, hobe da alderantzizko transkripzioa banan-banan egitea, baina inongo enpresaren alderantzizko transkriptasarik ezin du eragin hori lortzerik.Funtsean, alderantzizko transkriptasa gehienen eraginkortasuna % 30-50 artean ibiltzen da.Hori horrela bada, nahiko egonkorra izango litzateke alderantzizko transkripzioaren eraginkortasuna, hau da irudian ikusi nahi duguna: 3 RNAk 2 cDNA lortzen dituzte, 6 RNAk 4 cDNA lortzen dituzte, beraz, zenbat lagin kargatu den, alderantzizko transkripzioaren eraginkortasuna nahiko egonkorra da.Ez dugu ikusi nahi alderantzizko transkripzioaren eraginkortasuna ezegonkorra den eta kontzentrazio handia galarazten den egoera.

Beraz, nola egiaztatu alderantzizko transkripzioaren eraginkortasuna egonkorra den?Metodoa oso sinplea da, konparazio proba bat besterik ez duzu egin behar: bata RNAren diluzioa bikoiztu ondoren cDNAn alderantzikatzea da, eta bestea, cDNAn alderantzizko transkripzioaren ondoren diluzioa bikoiztua egitea da, eta, ondoren, qPCR egin lortutako malda koherentea den ikusteko.Goi mailako ikasle gisa, segundotan ulertu beharko zenuke.Jarraian erakusten den moduan:

RNA eta cDNA diluitzea alderantzizko transkripzioaren eraginkortasuna egonkorra den ala ez probatzeko
Alderantzizko transkriptasa eta kit
Nola izan ditzake PCR kuantitatibo fluoreszente perfektuak alderantzizko transkriptasa eta kit bikainak.Alderantzizko transkriptasa bi motatan banatzen da gutxi gorabehera iturriaren arabera, AMV edoM-MLV, eta haien errendimendua taulan agertzen denaren berdina da.

RNasa H jarduera
RNasa H Erribonukleasa H da, txinatar izena erribonukleasa H da, hau da, DNA-RNA kate hibridoan RNA hidroliza dezakeen endoribonukleasa bat da.H RNasak ezin ditu fosfodiester loturak hidrolizatu kate bakarreko edo bikoitzeko DNA edo RNAn, hau da, ezin du kate bakarreko edo bikoitzeko DNA edo RNA digeritu.CDNAren bigarren katearen sintesian erabili ohi da.

Gauza arraroa da.Alderantzizko transkriptasak RNasa H aktibitatea duela esaten dugu, ez alderantzizko transkriptasak RNasa H duela, eta agian ezinezkoa izango da RNasa H alderantzizko transkriptasatik bereiztea, agian alderantzizko transkriptasan talde jakin batzuen konformazioagatik Jarduera hau alderantzizko transkriptasak eragiten du.

Hori dela eta, AMVren alderantzizko transkripzioaren eraginkortasun handiagoa gorabehera, bere RNasa H jarduerak cDNA-ren etekina murrizten du.Jakina, erreaktiboen fabrikatzaileak etengabe optimizatzen ari dira beren produktuak RNasa H jarduera alderantzizko transkriptasan ahalik eta gehien kentzeko, cDNAren etekina handitzeko.
Erretiro-tenperatura

RNAren egitura sekundarioa tenperatura desberdinetan
Ikus goiko irudia tenperatura desberdinetan RNAren egitura sekundarioa ezagutzeko, eta erabili mFold lineako tresna xede-zatiaren egitura sekundarioa zehazteko tenperatura eta gatz-kontzentrazio baldintza zehatzetan.55 °C-tan, RNAren egitura sekundarioa oso konplexua da oraindik, alderantzizko transkriptasak ezin du funtzionatu eta bigarren mailako egitura ezin da guztiz konpondu 65 °C arte, AMV eta M-MLVren tenperatura optimoa tenperatura hori baino askoz txikiagoa den bitartean.
zer egin?Egitura sekundarioa txantiloiaren beraren parekatze osagarria da, eta horrek hasierako eta alderantzizko transkriptasaren eta txantiloiaren arteko lehia handia dakar, eta ondorioz, E baxua eta errepikagarritasun eskasa bezalako arazo batzuk sortzen dira.

zer egin?Ahal den neurrian bakarrik igotzeko tenperatura.

Erreaktiboen fabrikatzaile askok alderantzizko transkriptasa hobetzen ari dira ingeniaritza genetikoaren bidez.Batzuek erreakzio-tenperatura handitzen dute, Jifan eta Aidelai adibidez, eta beste batzuek RNasa H entzimaren talde aktiboa kentzen dute entzimaren eta RNA txantiloiaren arteko afinitatea hobetzeko.Afinitate handiak bigarren mailako egitura lehiakorki estutu eta leunki irakurri dezake, eta alderantzizko transkripzioaren eraginkortasuna ere asko hobetu dezake.
Gakoa: alderantzizko transkripzioa garrantzitsuagoa da alderantzizko transkripzioaren eraginkortasunaren koherentzia lortzeko (entzimak eraginkorrak izateaz gain egonkorrak ere izan behar dira), kargatutako lagin kopurua baino, eskala handiko PCR kuantitatibo fluoreszente bat ez bada, ez da batere posible izango.cDNA anitz.
Hainbat fabrikatzailek ere ahalegin batzuk egin dituzte koherentziaren bila.Esate baterako, enpresa gehienek alderantzizko transkripzioa kit estandar gisa paketatu dute orain, aukera ona da.
Adibidez, Foregene-ren RT Easy Series kitak:

RT Easy I (lehen katearen cDNA sintesi-kitaren aurrenahasketa nagusia)

MIQE (5) - xede genearen informazioa

Goiko irudiak azaltzen du
1. Gene hau errepikatutako esperimentuetarako eraginkorra den ala ez, oro har, esperimentu errepikatuen bidez egiaztatu daiteke.
2. Gene IDa, badakizu.
3. Genearen luzera, xede genearen guztizko luzera ez da zalantzarik gabe arazorik.Primerak diseinatzerakoan, ziurtatu anplikoiaren luzera 80-200bp artekoa dela anplifikazio eraginkortasun hobea bermatzeko.
4. Sekuentzia Blast konparazio informazioa, xede genea genebankuan alderatu behar da anplifikazio ez-espezifikoa saihesteko.
5. Pseudogenoen presentzia.Pseugenea gene normal baten antzeko DNA sekuentzia bat da, baina bere funtzio normala galtzen du.Askotan eukariotoen gene anitzeko familian dago.Normalean ψ-rekin adierazten da.Genomaren DNA genomikoaren kopia ez-funtzionala da, gene kodetzailearen sekuentziaren oso antzekoa dena., orokorrean ez dira transkribatzen, eta ez dute esanahi fisiologiko argirik.
6. Primeren posizioa exoien eta introiekiko.Hasierako urteetan, DNAren kutsaduraren arazoa konpontzen genuenean, sarritan erreparatzen genion abiarazleen, exoien eta introien posizioei, eta orokorrean introietan zehar abiarazleak diseinatzea pentsatzen genuen DNAren anplifikazioa ekiditeko.Mesedez, ikusi beheko irudia: beltzak introiak adierazten ditu, hainbat urdinek exoiak, arrosak lehengai arruntak eta gorri distiratsuak introiak barne hartzen dituenak.

Eskema, inoiz ez egia
Zein plan ezin hobea dirudi, baina, egia esan, kasu gehienetan, trans-introiaren abiarazleak ez dira imajinatu bezain magikoak, eta anplifikazio ez-espezifikoa ere eragingo dute.Beraz, DNA kutsatzea saihesteko modurik onena DNA erabat kentzea da.
7. Konformazioaren iragarpena.Adibide hau berriro erabiliz, erabili mFold lineako tresna xede-zatiaren bigarren mailako egitura zehazteko tenperatura eta gatz-kontzentrazio zehatz batean.

RNAren egitura sekundarioa tenperatura desberdinetan
Bigarren mailako egitura txantiloiaren beraren parekatze osagarria da, eta horrek hasierako eta txantiloiaren parekatzearen arteko lehia handia ekarriko du, eta inprimagailuak lotzeko aukerak txikiagoak dira, ondorioz, E baxua eta errepikakortasun eskasa bezalako arazo batzuk sortzen dira.Softwarearen iragarpenaren bidez, bigarren mailako egitura-arazorik ez badago, bikaina izango litzateke.Bada, gure jarraipen-artikuluak arazo hau nola konpondu zehazki aztertuko du.

MIQE (6)—qPCR Oligonukleotidoak

PCR kuantitatibo fluoreszenterako, egunero borrokatzen duzun lehenengo gauza RNA erauztea da, eta bigarrena inprimagailuen diseinua izan daiteke.
Lehenik eta behin, hasierako diseinuari buruzko arauak egiaztatzen ditugu MIQE kontrol-zerrendaren arabera.Hain da sinplea, ezen txaloek barre egin dezaketela, eta esaldi bakarrean amaitu dezakegu: jakin ezazu zein den lehen zundaren sekuentzia eta posizioa eta aldatzeko metodoa.Hasierako arazketa metodorako, hasierako sintesia oso merkea da gaur egun, qPCR-k PAGE eta arazketa metodoen gainetik merezi du, eta sintesi tresnaren informazioa ez da garrantzitsua.Jende askok hamarkadak daramatzate primerak egiten eta ez daki sintetizatzailea ABI3900 denik.
Primer diseinuaren printzipioei dagokienez, ez dituzu memoriaz memorizatu behar, primer diseinuko software edo sareko tresna gehienek arazo hauek ardura ditzaketelako (lineako tresna gomendatua primer3.ut.ee/), eta primer diseinuaren % 99,999 ez da eskuz egiten Begira, egileak batzuetan ehunka inprimaketa diseinatzen ditu egunean, banan-banan irakurtzen baduzu, gurutzatuta geratuko da.
Egiaztatu puntu hauek inprimaketak diseinatu ondoren:
1. Diseinatzea 3′ muturretik hurbil abiarazleak: cDNA lehen katearen sintesirako oligo dT abiarazleak erabiltzearen kasuan, alderantzizko transkripzioaren eraginkortasuna eta RNAren osotasuna kontuan hartuta, diseinatutako abiarazleak 3′ muturretik gertu diseinatu behar dira anplifikazioaren eraginkortasuna hobetzeko.Erabili irudi bat honela azaltzeko (ez dago hau ulertzeko modurik):

Zergatik diseinatu behar dira inprimagailuak 3′ amaieratik gertu, ez du egia izan behar
2. TM balioa: Tm balioa 55-65°C-tan dago (exonukleasaren jarduera altuena 60°C-tan baita), eta GC edukia %40-60koa da.
3. BLAST: genomaren anplifikazio ez-espezifikoa ekiditeko, Blast erabili behar da egiaztapen osagarrirako.

MIQE(7)—qPCR prozesua

1. qPCR kit
MIQE-ren eskakizunen arabera, argi eta garbi deskribatu behar ditugu artikuluan erreakzio-baldintza osoak, PCR erreakzio-sistemaren konfigurazioa barne, zer kit erabiltzen den, nor den fabrikatzailea, zenbateraino den erreakzio-sistema, koloratzaileen metodoa edo zunda metodoa erabiltzen den, PCR programaren ezarpenak.Gidari beteranoek, zalantzarik gabe, kit-a hautatzen den bitartean, goiko informazioa funtsean zehaztuko da.
Gaur egun, PCR kuantitatibo fluoreszenteen fabrikazioa eta ekoizpena teknologia oso heldua da.Fabrikatzaile oso txarrak aukeratzen ez dituzun bitartean, arazoak izateko probabilitatea ez da handia, baina oraindik puntu batzuk zurekin partekatu nahi ditugu:
Hasiera beroko Taq entzima:PCRren zatirik garrantzitsuena abiarazte beroko Taq entzima da.Merkatuan abiarazte beroko entzimak, oro har, bi motatan banatzen dira, bata kimikoki eraldatutako hasierako entzima bat da (parafina txertatze gisa imajina dezakezu), eta bestea, antigorputzak aldatzeko abiarazte beroko entzima bat da (antigeno-antigorputz lotura).Aldaketa kimikoa abiarazte beroko entzimen modu goiztiarra da.Tenperatura jakin batera iristen denean, entzimak bere jarduera askatuko du.Antigorputz aldatutako hot-start entzimak metodo biologikoak erabiltzen ditu entzimaren jarduera blokeatzeko.Tenperatura jakin batera iristen denean, antigorputza proteina gisa desnaturalizatu eta desaktibatu egingo da, eta entzimaren jarduera jarriko da martxan.

Hala ere, zertarako balio du honek?Hau da, antigorputzak eraldatutako entzimen askapen-jarduera kimikoki eraldatutako entzimenak baino azkarragoa da, beraz, sentikortasunari dagokionez, antigorputzak eraldatutako entzimek abantaila txiki bat dute, beraz, merkatuan dauden kitetan kimikoki eraldatutako entzimarik ez dago.Bada, fabrikatzaile honen teknologia oraindik milurteko garaian itsatsita dago.
Magnesio ioien kontzentrazioa:Magnesio ioien kontzentrazioa oso garrantzitsua da PCR erreakzioan.Magnesio ioien kontzentrazio egokiak Taq entzimaren jarduera askatzea susta dezake.Kontzentrazioa baxuegia bada, entzimaren jarduera nabarmen murriztuko da;kontzentrazioa altuegia bada, entzimak katalizatutako anplifikazio ez-espezifikoa hobetuko da.Magnesio ioien kontzentrazioa ere eragingo du abiarazteen errekuzimenduan, txantiloiaren urtze-tenperaturan eta PCR produktuetan, eta, ondorioz, zati anplifikatuen etekinean eragingo du.Magnesio ioien kontzentrazioa, oro har, 25 mM-tan kontrolatzen da.Jakina, kit on bat izateko, magnesio ioien kontzentrazioa ondo kontrolatu behar da.Merkatari batzuek magnesio ioiaren agente kelatzaile bat gehitzen diote erreaktiboari, eta horrek magnesio ioiaren kontzentrazioa automatikoki doitzeko efektua lor dezake.
Tindagai fluoreszenteen kontzentrazioa:Koloratzaile fluoreszenteak, erabili ohi dugun SYBR Green denak, fluoreszentzia sortzen du batez ere kate bikoitzeko DNAren zirrikitu txikiari lotuz, tindagaiaren lotzea bi kate biko DNAri ez-espezifikoa delako, hau da, kate bikoitzeko DNA harekin konbinatzen den bitartean, fluoreszentzia gerta daiteke, beraz, lehen-dimeroak sisteman eta DNA txantiloiak konbinatuko ditu hondoko seinaleak.
PS: argiarekiko sentikorrak diren propietateak direla eta, merkatuan dauden produktuak, oro har, zentrifuga-hodi marroi opakuetan ontziratzen dira (beheko irudian ikusten den bezala).Hala ere, honek arazo batekin topo egingo du.Laginketa egiterakoan likidoa zurrupatzen den ala ez ikustea zaila da.Alde horretatik, Qingke da benetan erabilgarriena (beheko irudian ikusten den bezala), eta hodi gardena latorrizko poltsa opaku batean ontziratzen da.Ondoren, latazko poltsa batean sartu, argia eta laginketa saihesteko erosotasuna kontuan hartuta.Produktu-zenbaki egokia aukeratu behar duzu.TSE204 super kostu-eraginkorra da, eta horrek belarra landatzeko gogoa ematen dit.

Tindagai fluoreszentearen kontzentrazioa ere oso garrantzitsua da.Kontzentrazioa baxuegia bada, anplifikazio-kurba ez da igoko azken fasean eta ez da perfektua;kontzentrazioa altuegia bada, zarata interferentziak eragingo ditu.PCR kuantitatibo fluoreszentea batez ere CT balioaren araberakoa denez, koloratzaile fluoreszentearen kontzentrazioa behar bezala doitzen ez bada, puntu baxua puntu altua baino hobea da.Noski, koloratzaileen kontzentrazio egokia da onena.

ROX: ROX koloratzaileak ondotik putzu fluoreszentzia-seinale akatsak zuzentzeko erabiltzen dira.Tresna-fabrikatzaile batzuek kalibrazioa eskatzen dute, beste batzuek ez.Adibidez, Thermo Fisher Scientific-en denbora errealeko PCR anplifikazio-tresna erabiltzeak kalibrazioa eskatzen du normalean, 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, etab. Kit orokorrek deskribatuko dute.
Foregene-ren qPCR Mix-ek ROX koloratzailea ere badu, hainbat modelotan erabiltzeko erosoa dena.

Denbora errealeko PCR Kit-Taqman

Hidrogeno-lotura ahulen tratamendua: Hidrogeno lotura ahulen tratamendua gai nahiko teknikoa da.Ezerk ez ditu kit askoren eskuliburuak irakurri, baina inork ez du gai hau aipatu.Izan ere, oso garrantzitsua da.Baseen konbinazioa hidrogeno-loturen indarraren araberakoa da batez ere.Hidrogeno-lotura sendoak anplifikazio normala dira, eta hidrogeno-lotura ahulek anplifikazio ez-espezifikoa dakar.Hidrogeno-lotura ahulak ezin badira ondo ezabatu, ezin da anplifikazio ez-espezifikoa saihestu.Egilearen esparruan, enpresa gutxi batzuek baino ez dute nabaritu arazo hau.Kit-a erosten duzunean, aukeratu nahi duzun kitaren inguruan irtenbiderik hartu duzun ala ez ikus dezakezu.

Erreakzio bolumena: 20-50ul sistema gehiago erabiltzen da, eta bolumen txikiagoek akatsak sor ditzakete.Oro har, kitaren argibideek PCR erreakzio-bolumenak erabiltzea gomendatuko dute.Ez izan adimentsu eta erabili bolumen txikiagoak kostuak aurrezteko.ren helburua.Merkatariek gomendatutako bolumena benetan probatu da, eta baliteke bolumen txikiek eragindako akatsen arazoa konpondu ezin izatea.
2. Hodi-plakaren fabrikatzailea eta artikulu-zenbakia
Denek ezagutzen dute PCR kuantitatibo fluoreszentearen printzipioa.Fluoreszentzia bilketa batez ere PCR hodi tapoien bidez egiten da.PCR kontsumigarriak aukeratzerakoan, arreta jarri bi punturi: argi-transmisio ona eta tresnarako egokia.Orokorrean, marka nagusien oholak eta hodiak ondo daude, baina egokitzapen aldetik kontu handiz aukeratu behar duzu, bestela ezingo duzu tresna erabili.

4. Goi mailako ezagutza

MIQE (8)—qPCR baliozkotzea
Hau da qPCRren lehentasun nagusia!Hainbeste heroi erori dira hemen hondarrera.Jakina, baliteke zortea izatea eta aztertu dituzun geneak sinpleak izatea ere, beraz, izotz kobazuloan zehar flotatu zenuen haizearekin batera.qPCRren egiaztapen-informazioa datuen fidagarritasuna probatzea da.Beharrezko egiaztapen-informazioa honela zerrendatzen dugu:

1.Zehaztasun-proba
Xede-genearen anplifikazioaren espezifikotasuna elektroforesiaren irudia banda bakarra den egiaztatuz aztertzen da;sekuentziazioaren egiaztapena;urtze-kurba gailur-mapa bakarra den ikusteko;digestio entzimak egiaztatzea eta beste metodo batzuk.
Hemen, t-n zentratuko garaanplifikazio ez-espezifikoaren analisia urtze-kurbak erabiliz.Orokorrean, inprimagailuak diseinatzen ditugunean, produktuaren zatiaren tamaina 80-200bp bitartekoa izan behar da, eta horrek PCR produktuaren urtze-tenperatura 80-85 °C bitartekoa da.Beraz, askotariko gailurrak badaude, beste anplifikazio produktu ez-espezifikoak egon behar dira;gailurra 80°C-tik behera agertzen bada, orokorrean primer-dimerotzat hartzen da;gailurra 85 °C-tik gora agertzen bada, oro har, DNAren kutsadura edo zati handien anplifikazio ezespezifikoa dela jotzen da.
Oharra: Batzuetan gailur bakarra dago 80 °C-tan.Une honetan, kontzeptu hori bete behar da.Litekeena da anplifikazioaren emaitzak lehen dimero guztiak izatea.

Urtze-kurba normala (gailur bakarra anplifikazio ez-espezifikorik gabe)

Urtze-kurba problematikoa (gailur faltsuen anplifikazio ez-espezifikoa)
【Kasuen azterketa】

Gailur nagusi bat dago, baina primer dimeroa larria da
Beheko irudiko gailur bakarreko urtze-kurbak zure begiak erraz engainatu ditzake, esperimentu perfektua dela pentsatuz, baina emaitza guztiz okerra da.Une honetan, urtze-tenperaturari begiratu behar diogu.Tenperatura gailurra 80 °C-tik beherakoa da, hau da, erabat primer-dimeroa.

Helburu-zatirik ez, primer-dimero guztiak
Hemen, nire anaia ezin da gelditu.Beheko argazkia zirriborro batek bidalitako telefono mugikor batekin ateratako argazkia da.Erabili zituen erreaktiboak industrian erabili ohi diren marka guztiak dira.T-aurrizki-marka batetik bestera T-aurrizki-marka batera aldatu zen.Uste dut dagoeneko asmatu duzula.Oihu egin zidan zakarrak: «Lehen argazkian erabilitako erreaktiboa ona da, eta gailurra bakarra da.Geroago, zuk gomendatutako erreaktiboa erabili ondoren, bigarren argazkia bezalakoa bihurtzen da, gailur mistoekin.Miserable egin nauzu.“
Bereizi bi grafikoak.Lehen begiratuan, batek gailur bakarra du, eta besteak gailur bikoitza.Zentzugabekeria, gailur bakarra ondo dago noski.Egia al da?
Dou E baino okerrago, beheko irudian bi irudiak jartzen baditut, berehala ulertuko duzu.Izan ere, modu errazean gelditzen gaitu argazki mota honek.Ondo aztertu ondoren, zera ikusi dugu: lehenengo irudiaren gailurra 75 °C-tan dago, hau da, erabat primer-dimeroa;bigarren irudiko gailurra 75°C eta 82°C-tan agertzen da, gutxienez daude Produktua agertzen da.

Ikasleen iritzien argazkiak
Beraz, oinarrizko arazoa ez da erreaktiboen arazoa, primer diseinuaren arazoa baizik.Aldi berean, marka handi batzuk burdinazko kalitatekoak ez direla frogatzen du, eta nire anaiak lehen esandakoa ere frogatzen du: Ez da zure artikulua onartzen duen marka erreaktiboa.Zure artikulua da erreaktiboen marka sustatzen duena.Imajinatu, zakarrak erreaktiboak aldatuko ez balitu, datu okerrak aldizkarira bidaliko lirateke, eta gertatuko zena tragedia izango litzateke.
2. Kontrol hutsaren Ct balioa
Ez azaldu, kontrol hutsak Ct balioa badu, ez al da kutsadura?Hala ere, oraindik ulertu behar duzu zein kontrol hutsak duen Ct balioa.NTC bada, DNA arrotza dagoela esan nahi du, esate baterako, erreaktiboen kutsadura.NRT bada, ateratako RNAak DNA kutsatuta duela esan nahi du.
3. Kurba estandarra
Malda eta kalkulu formula barne, PCR efizientzia kalkula daiteke formularen bidez.Esperimentu perfektu batek kurba estandarraren malda 3,32ra hurbiltzea eta R² 0,9999ra hurbiltzea eskatzen du.
4. Barruti dinamiko lineala
Erreakzioaren barruti dinamikoa lineala da.Kurba estandarra sortzeko erabilitako txantiloiaren arabera, barruti dinamikoak gutxienez 5 kontzentrazio-gradiente izan behar ditu, eta arreta jarri Ct balioen aldaketari kontzentrazio-gradiente handietan eta kontzentrazio-gradiente baxuetan.
5. Detekzio-zehaztasuna
qPCR emaitzen aldaketak, hau da, errepikagarritasun eskasa, hau da, zehaztasun eskasa, faktore askok eragiten dute, besteak beste, tenperatura, kontzentrazioa eta funtzionamendua.qPCR zehaztasuna, oro har, gutxiago kontrolatzen da kopia-kopurua murrizten den heinean.Egokiena, aldakuntza esperimentalaren barruan, aldakuntza tekniko hau aldakuntza biologikotik bereiztea izan beharko litzateke, eta erreplika biologikoek zuzenean zuzendu ditzakete talde edo tratamenduen arteko qPCR emaitzetan dauden desberdintasun estatistikoak.Diagnostiko-saioetarako bereziki, saiakuntzen arteko zehaztasun onena (errepikapena) gune eta operadoreen berri eman behar da.
6. Detektatzeko eraginkortasuna eta LOD (qPCR multiplexean)
LOD detektatu diren lagin positiboen %95eko kontzentrazio baxuena da.Beste era batera esanda, xede gene-erreplikatu multzo baten barruan dagoen LOD-aren kontzentrazioa ez da huts egin duten erreakzioen % 5 gainditu behar.qPCR multiplexaren analisia egitean, batez ere puntu-mutazioak edo polimorfismoak aldi berean detektatzeko, qPCR multiplexak hodi berean xede-zati anitzen zehaztasuna arriskuan ez dagoela frogatu behar du, detekzio anitza eta hodi bakarreko detekzio Eraginkortasuna eta LOD berdinak izan behar dira.Batez ere kontzentrazio handiko xede-geneak eta kontzentrazio baxuko xede-geneak aldi berean anplifikatzen direnean, arazo honi arreta jarri behar zaio.
Arazoak eta irtenbideakOro har, qPCR arazketan aurkitu ohi diren arazoak alderdi hauetan oinarritzen dira:
·anplifikazio ez espezifikoa
· Primer-kontzentrazioaren aukeraketa zaila eta lehen-dimeroekin arazoak
·Errekuntza-tenperatura ez da zehatza
·Bigarren egiturak anplifikazio-eraginkortasuna eragiten du
anplifikazio ez espezifikoa
anplifikazio ez-espezifikoagertatzen da, orokorrean hasierako diseinua egokia ez den ala ez kontuan hartzen da, baina hasierak aldatzeko presarik ez baduzu, metodo hauek proba ditzakezu lehenik (printzipioa ere erantsita dago):
·Harritzeko tenperatura – saiatu mantendu ezin diren hidrogeno-lotura ahulak egiten;
·Errekuntza eta luzapen-denbora laburtu - hidrogeno-lotura ahulak izateko aukera murrizten du;
·Primer kontzentrazioa murriztea – murriztea abiarazle erredundanteak eta xede ez diren eskualdeak lotzeko aukera;
Anplifikazio-eraginkortasun baxua
Anplifikazio ez-espezifikoaren aurkako egoera: anplifikazio-eraginkortasun baxua, eta anplifikazio-eraginkortasun baxuari aurre egiteko neurriak guztiz kontrakoak dira:
·Errekuntza eta luzatze denbora luzatzea;
·Aldatu hiru urratseko PCRra eta murriztu errekozitzeko tenperatura;
·Inprimagailuaren kontzentrazioa handitu;
Ps: 90eko hamarkadan jaiotako ikasle askok ez dute esperimentuak nola arazketa egin aztertzeko prest, eta kitak arazoa guztiz konpondu dezakeela espero dute (graduatu ondoren ikerketa eta garapena egitera erreaktiboen enpresa batera joan nahi baduzu), izan ere, erreaktiboen fabrikatzaileek ere horrela pentsatzen dute, ergela izatea espero dut. Lortzen duzunean erabil daiteke, beraz, erreaktiboen fabrikatzaileek arazo zehatz batzuk konpontzen ez dituzten ahaleginak konpondu ditugu. loturak xurgatzeko faktoreak.Arazoa erraz konpontzeko, tontoek oraindik erreaktiboen konpainiaren sarrera irakurri behar dute hidrogeno-lotura ahulak xurgatzen dituen faktorerik ba ote dagoen ikusteko.
Primer-kontzentrazioaren aukeraketa zaila eta lehen-dimeroekin arazoak
1. metodoa: Oro har, qPCR-rako kitaren argibideek gomendatutako sistemak eta lehen kontzentrazio gomendatuak dituzte.
2. metodoa: Araztu inprimagailuaren kontzentrazio-gradientea ezarriz.Beheko argazkia enpresa bati lapurtu diote ilustratzeko.Beheko irudian hiru primer kontzentrazio gradienterekin (100nM, 250nM, 500nM) eta lau txantiloi kontzentrazio gradienterekin (0,1ng, 1ng, 10ng, 100ng) egindako fluoreszentzia emaitza kuantitatiboak erakusten dira.Emaitza esperimentalen Ct balioa honela adierazten da:

Primer kontzentrazioa hautatzea Primer kontzentrazio bakoitza lerro batean kateatu honela:

Primer kontzentrazioa aukeratzea begi-bistakoa da, 100nM eta 250nM lehen kontzentrazioen erlazio lineala hobea da eta 500nM lehen kontzentrazioen erlazio lineala nahiko eskasa da.100 nM eta 250 nM-tan, 250 nM-ko Ct balioa nahiko txikia da, beraz, primer kontzentrazio optimoa 250 nM da.Orokorrean primer-dimero gogorrak ikus daitezke urtze-kurban.Zer gertatzen da diseinatutako lehengaiek ezin badute inprimagailu-dimerorik saihestu?
3. metodoa: Primer-kopurua murriztea eta erretiro-tenperatura igo (ez dago azaldu beharrik).
Errekuzitzeko tenperaturaren balio enpirikoa 60 °C da.Ziur ez bazaude, nola hautatu errekostatzeko tenperatura egokiagoa?Erantzuna primer kontzentrazioa aukeratzeko berdina da -gradiente proba.Hartu argazki bat Bio-rad konpainiaren arazoa ilustratzeko.Xede zati jakin baten anplifikaziorako, ezarri zortzi tenperatura-gradiente, bakoitza hiru errepikapenekin, eta lortutako anplifikazio-kurba hau da:

erretiro-tenperatura hautatzea:
·70°C, 69°C—Funtsean, hasierakoak ezin dira konbinatu, beraz, ez dago anplifikaziorik.
·67,3°C – Hasieran anplifikazio txiki bat dago, eta Ct balioa nahiko handia da.
·64,5°C——Ct balioa gutxitzen da.
·60,7 °C, 58,0 °C, 56,2 °C eta 55,0 °C-tan, Ct balioak, funtsean, egonkorrak izan ohi ziren, baina azken fluoreszentzia balioak desberdinak ziren.
Nola aukeratu?Printzipioa: lehen printzipioa Ct balio handiagoa da.Ct balio bererako, aukeratu erretiro-tenperatura handiagoa dimerizazioa eta anplifikazio ez-espezifikoa saihesteko.55 °C-tan fluoreszentzia-balio handiagoa dagoen arren, dimeroak edo anplifikazio ez-espezifikoa egon daitezke bertan.
Baina zu bezain inteligentea bazara, zalantzarik gabe pentsatuko duzu: Logikoki hitz eginez, PCR erreakzioa oso zehatza bada, lehen kontzentrazioa gutxieneko eskakizuna gainditzen duen bitartean, puntu altuek eta baxuek ez lukete eraginik izan behar, koloratzaile fluoreszenteek eta dNTPek bezala.Izan ere, erretiro-tenperatura behar bezala optimizatzen den bitartean, primer-kontzentrazioen eragina Ct balioan naturalki murriztuko da.

Egokitze-tenperatura behar bezala optimizatzen da, eta primer-kontzentrazioa CT-n duen eragina minimizatuko da
Bigarren mailako egiturak anplifikazio-eraginkortasuna eragiten du
Har dezagun Bio-rad-eko argazkia arazoa ilustratzeko.Tenperatura-gradiente bat ere diseinatzen du bigarren mailako egitura duen gene bat anplifikatzeko.

Bigarren mailako egitura sortzen da
Ikusten denez, tenperatura-gradientea jaisten den heinean, produktuak agertzen hasten dira eta Ct balioa aurrera egiten du, 60,7°C-tan gutxieneko baliora iritsiz, eta gero tenperatura-gradientea jaisten den heinean, Ct balioa handiagoa da.Aitzitik, tenperatura igo ahala, bigarren mailako egitura irekitzen da eta anplifikazio-eraginkortasuna handitzen da.Tenperatura jakin batera iritsi ondoren, tenperatura handitzeak ezin du anplifikazioaren eraginkortasuna hobetu.Primerak ezin direlako modu egonkorrean konbinatu momentu honetan.Horregatik,bilatu Ct balio baxuena duen tenperatura, zein da bigarren mailako egitura txantiloia handitzeko tenperatura onena!Noski, ergel adimendunek jakin behar dute beharrezkoa ez bada, hobe dela lehengaiak aldatzea eta bigarren mailako egitura eskualdea saihestea.
5. Aplikazio maila
MIQE—Datuen analisia

Datuen analisia PCR kuantitatibo fluoreszenteak ematen du batez ere.Aurreko artikuluan datuen azterketa lan asko egin da, esperimentuaren diseinuan azaldu den kontrol hutsa adibidez.Barne erreferentziako geneak, errepikatutako zenbakiak eta abar argitu dira., hemen batez ere qPCRren aplikazioa azaltzen dugu.
qPCR asko erabiltzen da, eta egiaztapen esperimentala eta azido nukleikoen diagnostikoa dira gehien erabiltzen diren eszenatokiak.
kuantifikazio absolutua
Log (hasierako kontzentrazioa) erlazio lineala du ziklo kopuruarekin.Hasierako kopia-zenbaki ezaguna duen estandar batetik kurba estandar bat marraz daiteke, hau da, anplifikazio-erreakzioaren erlazio lineala lor daiteke.Laginaren Ct balioaren arabera, laginaren kontzentrazioa kalkula daiteke.Sartu beharreko txantiloien kopurua.

Kalkulu Kuantitatibo Absolutuen Metodoa
Kuantifikazio absolutua kurba estandarrean oinarritu behar da.Kurba estandarra egiteko, estandar bat behar da.Normalean, estandarra xede genea klonatuz lortutako plasmido bat da.Zergatik da plasmido bat?DNA plasmido zirkularra egonkorrena delako.Diluitu produktu estandarra 5 eta 6 gradientetan bikoizketa-erlazioaren arabera (10 aldiz diluzioa), eta arreta jarri uniformetasunari diluitzean.Utzi Ct balioa 15-30 artean.

Prestaketa estandarra
Aldi berean, probatu beharreko lagina ere horren arabera diluitu behar da (gogoratu diluzio-faktorea), eta Ct balioa ere 15-30 artean kokatu behar da.Produktu estandarra + probatu beharreko lagina batera jartzen dira makinan.Proba egin ondoren, kurba estandarra egin zen substantzia estandarrarekin, eta probatu beharreko laginak kurba estandarrera eraman ziren kontzentrazioa kalkulatzeko.
B hepatitisaren birusa HBV kuantifikazioa kuantifikazio absolutu tipikoa da, birusaren kopia kopurua 1 ml odolean kalkula dezakeena.
Kopiaren zenbakiaren kalkulua
Probatu beharreko laginaren kontzentrazioa (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × diluzio-faktorea
Laginaren pisu molekularra = base kopurua × 324
Probatu beharreko laginaren kopia-zenbakia (kopiak/ul) = probatu beharreko laginaren kontzentrazioa / laginaren pisu molekularra × 6 × 1014

Kopiaren zenbakia kalkulatzeko metodoa

Aurrekoa kantitatea zehazteko kalkulu-metodoa da.Batxilergoan amaitu ondoren ebatzi daitekeen arazo matematiko bat da, eta problema matematikoak, oro har, ordenagailuek ebazten dituzte.Ez baduzu ulertzen, etor zaitezke komunikatzeko.
kuantifikazio erlatiboa
Kuantifikazio erlatiboa ikerketa zientifikoan erabiltzen da batez ere.Zenbat birus dauden 1ml odolean, eta DNA birusa da, gertaera nahiko deterministikoa da: odol kantitatea zehaztu daiteke, eta DNA birusa nahiko egonkorra da.Hala ere, zaila zaigu hosto bateko gene jakin baten transkripzio-kopia kopurua konparatzea, zaila delako hostoaren tamaina, pisua eta samurtasuna zehaztea, ateratako RNA-kopurua zehaztea eta alderantzizko transkripzioaren eraginkortasuna ere zaila baita zehaztea, hau da, edozein urratsek datu esperimentalak akatsak izan ditzakete eta ezin dira erabili.
Beraz, kuantifikazio erlatiboak elementu bat sartu behar du:barne erreferentziako genea.
Beste era batera esanda, kuantifikazio erlatiboa xede-genearen eta barne erreferentzia-genearen arteko konparazioa da.Ehun berean eta zelula berean konparatuta, laginaren tamainaren, RNA erauzketa kopuruaren, alderantzizko transkripzioaren eraginkortasunaren eta PCRren eraginkortasunaren eragina nahiko txikia da.Laginaren tamaina txikia zela eta, bai barne erreferentziako geneak bai xede geneak nahiko murriztu ziren.Horregatik, uniformetasuna eta egonkortasuna azpimarratu izan ditugu aurretik.
Barne erreferentziako geneak dira, oro haretxeko geneak(etxe-etxeko geneak), zelula guztietan modu egonkorrean adierazten diren gene-klase bati erreferentzia egiten diote eta haien produktuak beharrezkoak dira zelulen oinarrizko bizitza-jarduerak mantentzeko.
Ez nahastu kontzeptu hau.Etxeko geneak funtzio biologikoko terminoak dira, eta barne erreferentziako geneak termino tekniko esperimentalak dira.Etxebizitza-geneek baliozkotzea gainditu behar dute barneko erreferentzia-gene gisa hautatu ahal izateko.
Esaterako, beheko irudian etxeko hainbat gene aukeratu genituen ehun-zelula ezberdinetan haien adierazpen-mailak probatzeko, eta β-2-mikroglobulinaren adierazpen-mailak beste hiru geneen espresio-mailak oso desberdinak zirela ikusi genuen, beraz, ezin ziren barne erreferentziako gene gisa erabili.

Barne-erreferentzia-genearen zuzenketa-funtzioa ulertu ondoren, bi algoritmo ateratzen dira barne-erreferentzia-genearen sarrera dela eta.
·Kurba estandar bikoitzeko metodoa
·2 – △△Ct metodoa (CT balioen alderaketa metodoa)
Espezieak eta geneen funtzioak aztertzea interesatzen bazaizu, mesedez, utzi algoritmoen ikerketari eta erabili formulak zuzenean, edo zuzenean erabili makinak;Matematikan eta ingeniaritzan mutil zuzena bazara, mesedez, lasai.
kurba estandar bikoitzeko metodoa
Kuantifikatu kontrol-laginaren xede-genea eta garbiketa-genea eta probatu beharreko lagina kurba estandarraren bidez, eta gero kalkulatu balio erlatiboa kalkulu-formularen arabera, hau da, adierazpen-maila erlatiboa.
Abantailak: analisi sinplea, optimizazio esperimental nahiko sinplea
Desabantaila: gene bakoitzeko, esperimentu-txanda bakoitzak kurba estandar bat egin behar du
Aplikazioa: gene-espresioaren erregulazioa aztertzeko gehien erabiltzen eta ezagutzen diren bi metodo kuantitatibo erlatiboetako bat.
Formula hau da:

Adibideak honako hauek dira:

Kalkulatu zenbateko erlatiboa emaitza kuantitatiboaren arabera
2 – △△Ct metodoa (CT balioen alderaketa metodoa)

Abantailak: Ez da kurba estandarrik egin behar
Desabantailak: anplifikazio-eraginkortasuna %100etik gertu dagoela suposatzen da;desbideratze estandarra <% 5 da, eta kurba estandarra eta anplifikazio bakoitzaren arteko eraginkortasuna koherenteak direla suposatzen da;baldintza esperimentalen optimizazioa zailagoa da.
Aplikazioa: gene-espresioaren erregulazioa aztertzeko gehien erabiltzen eta ezagutzen diren bi metodo kuantitatibo erlatiboetako bat.

Jakina, anplifikazio-eraginkortasuna ezinezkoa izan ohi da 1. Zuzenketa-metodoa: badakigu xede-geneak eta erreferentzia-geneak anplifikazio-eraginkortasun bera dutela, baina anplifikazio-eraginkortasuna ez dela 1eko berdina, orduan 2－△△Ct honela zuzendu daiteke: (1+E)－△△Ct, adibidez, anplifikazio-eraginkortasuna zuzentzen bada, 0 △△Ct. 1,95－△△Ct
Orain arte, PCR kuantitatibo fluoreszenteari buruzko edukia amaitu da.